[논문]단백질 기능 향상을 위한 방향적 진화

강환구; 김학성

문제 정의

최근 기존의 방법보다 매우 빠 로고 획기적으로 효소의 기능을 개량함 수 있는 방향적 진화 ( Directed evolution) 방법이 보고되면서 이를 효소뿐만 아니라 단백질에도 광범위하게 활용하고자 하는 연구가 급속도로 증가하고 있다. 본 고에서는 단백질과 효소의 기능을 획기적 으로 개량하는 방향적. 진화 방법과 이의 구체적인 적용사례 에 대해 기술하고자 한다.
본 고에서는 단백질과 효소의 기능을 획기적 으로 개량하는 방향적. 진화 방법과 이의 구체적인 적용사례 에 대해 기술하고자 한다.
본 논문에서는 directed evolution 을 이용하여 Bacillus subtilis subtilisin E를 theriniactirioniyces vt汀garis의 thermophilic enzyme인 thennitase의 기능을 갖도록 converting하는 연구를 수행하였다. subtilisin E를 error-prone PCR에 의하여 random mutagenesis를 수행하고 이를 staggered extension process (StEP)에 의하여 in vitro recombination한 후 이를 B.
그 중요성 때문에 subtilisine 매우 활기차게 연구되어왔고 100 개가 넘는 crystal structure가 분석되었다. 본 연구에서는 다양한 subtilisin을 family shuffling하여 4가지의 성질과 이들의 조합에 대한 성능 향상을 꾀하였다.
이러한 비 천연 아미노산의 생산은 hydantoin 유도체를 기질로 하여 D-hydantoinase와 N-carbamoylase를 이용하는 효소공정이 매우 경제적인 것으로 알려지고 있고 실제 전 세계적으로 많은 기업이 사용하고 있다. 본 연구에서는 두 효소를 fusion 시켜 반응에 사용할 경우보다 효율적으로 생산공정을 개발할 수 있욜 것이라 생각하여 두 효소를 coding하는 유전자를 fusion 시元고 이를 대장균에 발현시켰다. 그러나, 이 경우 fusion enzyme의 안정성이 낮은 것으로 관찰되어 fusion gene을 template로 하여 방향적 진화를 시도하였다.

제안 방법

단백질 혹은 효소의 구조나 기능에 대한 구체적인 data가 없는 경우에 매우 효율적으로 단백질이나 효소의 기능을 개 량할 수 있는 방법으로 이의 기본 개념은 Figure 1 과 같다. 즉, 먼저 단백질이나 효소의 유전자에 여러가지 방법으로 변이를 유도한 다음 이를 적당한 숙주세포에 발현 시켜 mutant library를 구축한다. Library 로부터 특성이 개량된 positive mutants를 적당한 방법으로 선별하고 이를 다음 단계 의 template로 사용하여, 단백질이나 효소의 기능이 목적하는 만큼 개량될 때까지 이러한 과정을 반복한다.
이때 용이한 선별올 위해 각각의 vector는 서로 다른 항생제 내성을 갖도록 구축한다. 제한 효소의 절단부위를 이용하여 3' 말단으로부터 internal truncation을 수행한 ORF1과 5' 말단으로부터 internal truncation 을 실행한 ORF2 를 확보한다. 이로부터 하나의 library의 유전자 단편을 분리하여 다른 library의 유전자에 fusion시키게 되면 mutant library가 구축된다.
이 유전자가 가지고 있는 non-essential mutation올 없애기 위해 ST-1 을 40배 많은 WT DNA와 함께 2번 shuffling한 결과 silent mutation이 제거된 640 您/mL의 MIC를 갖는 새로운 8-lactamase(ST-2)틀 얻었다. 결과적으로 3번의 shuffling 을 통하여 32,000배의 resistance 향상을 얻을 수 있었다.
그러나 특히 진핵생물에서는 더 강한 형광이 필요하다. 이 연구에서는 이를 위해 codon usage 변경과 DNA shuffling을 이용하여 mutant library를 만든 다음 가장 밝은 E. coli colony 를 screening 하였다
Cephalosporin으로부터 반합성 항생제를 생산하는 과정에서 carboxylic acid의 보호기로 para-nitrobenzyl alcohol (pNB-OH) 가 이용되는데 반응이 끝난 후 보호기를 제거하기 위해 esterase를 이용하는 것이 가능하다 그러나, 이러한 반응은 주로 유기용매에서 친행되므로 유기 용매에 대해 pNB esterase의 안정성을 증가시키기 위해 방향적 진화를 시도하였다. 구체적인 방법으로 유전자 1 kb 당 1-3개의 치환을 유 발하도록 error-prone PCR을 수행하여 mutant library를 만든 후 유기용매인 dimethylflormamide(DMF)와 완충용액 및 pNP 기질과 함께 mutant를 반응시켜 노란색을 발색하는 colony를 선별하였다.
Cephalosporin으로부터 반합성 항생제를 생산하는 과정에서 carboxylic acid의 보호기로 para-nitrobenzyl alcohol (pNB-OH) 가 이용되는데 반응이 끝난 후 보호기를 제거하기 위해 esterase를 이용하는 것이 가능하다 그러나, 이러한 반응은 주로 유기용매에서 친행되므로 유기 용매에 대해 pNB esterase의 안정성을 증가시키기 위해 방향적 진화를 시도하였다. 구체적인 방법으로 유전자 1 kb 당 1-3개의 치환을 유 발하도록 error-prone PCR을 수행하여 mutant library를 만든 후 유기용매인 dimethylflormamide(DMF)와 완충용액 및 pNP 기질과 함께 mutant를 반응시켜 노란색을 발색하는 colony를 선별하였다. 4번의 반복적인 진화과정을 통해 50-60배 정도 안정성이 증대된 효소를 얻을 수 있었다.
1.6kb 유전자중 58-82%의 DNA sequence 동일성을 갖는 4개의 유전자들을 각각 또는 한꺼번에 shuffling하였다. 이들의 moxalactam에 대한 저항성을 측정한 결과 4가지 유전자를 각각 shuffling 한 것은 모두 8배의 향상을 보인 반면, 4가지 유 전자를 한꺼번에 family shuffling한 것은 270-540배의 향상을 보였다.
본 논문에서는 directed evolution 을 이용하여 Bacillus subtilis subtilisin E를 theriniactirioniyces vt汀garis의 thermophilic enzyme인 thennitase의 기능을 갖도록 converting하는 연구를 수행하였다. subtilisin E를 error-prone PCR에 의하여 random mutagenesis를 수행하고 이를 staggered extension process (StEP)에 의하여 in vitro recombination한 후 이를 B. subtilis 에 transformation하고 이를 96-weIl plates 방법을 틍하여 screening하였다. 이 결과 83℃ 에서 이 enzyme의 half life가 200배 이상 증가되었고 optimum temperature가 76℃로 증가 됨을 보였다.
25개의 subtilisin 과 상업적으로 이용되는 subtilisin 인 Savinase 를 shuffling하여 Bacillus subtilis 168에 transformation 하고 screening하였다. 654개의 clone을 4개의 성질 - 231에 서의 활성, 열안정성, 유기용매 안정성, pH 영향성-에 대해 조사하였다.
25개의 subtilisin 과 상업적으로 이용되는 subtilisin 인 Savinase 를 shuffling하여 Bacillus subtilis 168에 transformation 하고 screening하였다. 654개의 clone을 4개의 성질 - 231에 서의 활성, 열안정성, 유기용매 안정성, pH 영향성-에 대해 조사하였다. 종종 효소의한 성질을 향상시키면 다른 성질은 떨어지는 경우가 있었는데 본 연구에서는 molecular breeding 이 이러한 점을 극복하고 좋은 성질만을 조합시킬 수 있는가 를 알아보기 위한 것을 목적으로 하였으므로 654개의 clone 을 5가지 조건에서 활성을 측정한 결과 모든 기존의 효소보다 뛰어난 mutant를 얻을 수 있었다.
이런 자연계의 진화를 실험실에서 수행 함으로서 자연계의 진화에 대한 이해와 함께 산업적으로도 가치가 있는 새로운 기능을 갖는 새로운 효소를 창출할 수 있다. 이 논문에서는 indole・3.glycerol・phosphate synthase (1GPS) 를 phosphoribosylanthranilate isomerase (PRAl) 로 변화 시켰는데, 이들은 모두 / barrel 형의 구조를 갖고 있으며, tryptophan biosynthesis에 관여한다. 이미 알려진 효소의 3 차 원 구조를 비교함으로서 superimpose 되지 않는 3 부분을 찾 아내고 이들 무문에 적당한 크기의 random peptide를 삽입하여 IGPS롤 PRA】로 진화시켰다.
glycerol・phosphate synthase (1GPS) 를 phosphoribosylanthranilate isomerase (PRAl) 로 변화 시켰는데, 이들은 모두 / barrel 형의 구조를 갖고 있으며, tryptophan biosynthesis에 관여한다. 이미 알려진 효소의 3 차 원 구조를 비교함으로서 superimpose 되지 않는 3 부분을 찾 아내고 이들 무문에 적당한 크기의 random peptide를 삽입하여 IGPS롤 PRA】로 진화시켰다.
그러나, 이 경우 fusion enzyme의 안정성이 낮은 것으로 관찰되어 fusion gene을 template로 하여 방향적 진화를 시도하였다. Mutant library로 부터 D-Hydantoinase와 N-carbamoylase 활성을 동시에 나타내는 변이주를 선별하고 이로부터 다시 안정성이 증대된 변 이주를 선별하였다. 결과적으로 3번의 반복적인 방향적 진화 과정을 거쳐 안정성이 증대된 변이주를 선별하였고 이를 비 천연 아미노산 생산에 적용하였다
Mutant library로 부터 D-Hydantoinase와 N-carbamoylase 활성을 동시에 나타내는 변이주를 선별하고 이로부터 다시 안정성이 증대된 변 이주를 선별하였다. 결과적으로 3번의 반복적인 방향적 진화 과정을 거쳐 안정성이 증대된 변이주를 선별하였고 이를 비 천연 아미노산 생산에 적용하였다

성능/효과

coli mutator strain을 이용하는 것이다. DNA repair mechanism 인 mismatch repair(mutS), oxo-GTP repairfmutT) 그리고 DNA pol 出의 3t -5t exonuclease activity(mutD)가 결여된 E.coli 균 주는 wild type에 비해서 mutation rate가 5000 배나 높은 것으로 확인되었고, 이러한 균주를 이용하면 특정유전자의 mutant library 를 구축하는데 유용하게 활용될 수 있다. Mutator strain을 이용할 경우 다른 방법과는 달리 in-vitro에서 mutation을 일으켜 숙주에 transformation하는 과정을 생략 하고 바로 selection 이나 screening할 수 있는 장점을 가지고 있다.
2. 전체 double-stranded random fragment 중 한 종류의 농도 는 0.1%정도일 때 가장 효율적이다.
3. Template double-stranded polynucleotide는 5-5OOObp 정도로 최소 종류 이상이다.
본 특허에서 error-prone PCR과 cassette mutagenesis의한 계를 분석했는데 error-prone PCR의 경우, 첫째 polymerase 자체가 낮은 processibility릍 가지고 있어서 평균 크기의 유전 자를 random mutagenesis 하기에 중분하지 못하다는 것과, 둘 째 그 유전자의 information content가 증가할수록 기능이 나 빠진 mutam의 비율이 높아져 선별이 힘들어진다는 것, 그리고 셋째 PCR를 계속할수록 neutral mutation 이 축적되어 immunog前city를 초래할 수 있다는 것이다. C技랴te mutagenesis 의 경우 random sequence block의 크기와 개수의 한계 때문에 다른 중요한 부분을 놓칠 가능성이 많다는 한계가 있다.
pl82Sfi를 통해 발현되는 TEM-1 8-lactamase를 가지고 있는 재조합 대장균에 대한 cefotaxime의 M1C는 0.02 “g/mL이 다 이 TEM-1 유전자의 DNA shuffling을 통해서 mutant를 얻었을 때, error prone PCR과 비슷한 0.7%의 point mutation 이 발생하였으며 3번에 걸친 round를 통해 MIC가 320 俸/mL의 내성을 가진 것을 얻을 수 있었다. 이렇게 선택된 transformante mutant -lactamase 유전자(ST-1)는 9개의 염 기치환과 4개의 silent mutation을 가지고 있었다.
이 유전자가 가지고 있는 non-essential mutation올 없애기 위해 ST-1 을 40배 많은 WT DNA와 함께 2번 shuffling한 결과 silent mutation이 제거된 640 您/mL의 MIC를 갖는 새로운 8-lactamase(ST-2)틀 얻었다. 결과적으로 3번의 shuffling 을 통하여 32,000배의 resistance 향상을 얻을 수 있었다. 이것은 3번의 연속적 selection을 통한 error-prone PCR을 통해 얻을 수 있었던 최고치인 0.
또한 이 cycle 3 GFP를 mammalian cell 인 CHO cell 에서 발현시킨 결과 역시 WT에 비해 42배의 fluorescence 증가를 보임으로서 eucaryotic cell에서도 충분히 reporter gene으로 이 용될 수 있음을 보여주었다
구체적인 방법으로 유전자 1 kb 당 1-3개의 치환을 유 발하도록 error-prone PCR을 수행하여 mutant library를 만든 후 유기용매인 dimethylflormamide(DMF)와 완충용액 및 pNP 기질과 함께 mutant를 반응시켜 노란색을 발색하는 colony를 선별하였다. 4번의 반복적인 진화과정을 통해 50-60배 정도 안정성이 증대된 효소를 얻을 수 있었다.
6kb 유전자중 58-82%의 DNA sequence 동일성을 갖는 4개의 유전자들을 각각 또는 한꺼번에 shuffling하였다. 이들의 moxalactam에 대한 저항성을 측정한 결과 4가지 유전자를 각각 shuffling 한 것은 모두 8배의 향상을 보인 반면, 4가지 유 전자를 한꺼번에 family shuffling한 것은 270-540배의 향상을 보였다. 이렇게 얻은 resistant clone 은 다른 8-lactam antibiotic에 대한 저항성도 증가하였다.
subtilis 에 transformation하고 이를 96-weIl plates 방법을 틍하여 screening하였다. 이 결과 83℃ 에서 이 enzyme의 half life가 200배 이상 증가되었고 optimum temperature가 76℃로 증가 됨을 보였다. 또한 succinyl~Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide 의 hy击olysB activity?}- ]0℃로부터 90℃ 전 범위에 걸쳐 크게 향상되었다.
또한 succinyl~Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide 의 hy击olysB activity?}- ]0℃로부터 90℃ 전 범위에 걸쳐 크게 향상되었다. 또한 directed evolution된 subtilisin 日는 약 8개의 amino acid 치환이 주효한 것으로 나타났으며 이들 amino acid들은 enyme의 표면에 위한 것으로 밝혀졌다. 결론적으로 이 논문을 통하여 directed evolutione enzyme 의 thermostability 증 가를 이루는 효율적 방법임을 알 수 있었고 또한 thermophilic enzyme의 생성에 관한 mechanism을 알게 해 주었다.
또한 directed evolution된 subtilisin 日는 약 8개의 amino acid 치환이 주효한 것으로 나타났으며 이들 amino acid들은 enyme의 표면에 위한 것으로 밝혀졌다. 결론적으로 이 논문을 통하여 directed evolutione enzyme 의 thermostability 증 가를 이루는 효율적 방법임을 알 수 있었고 또한 thermophilic enzyme의 생성에 관한 mechanism을 알게 해 주었다.
Herpesviral thymidine kinase(TK) 는 human thymidine kinase에 비해 상대적으로 낮은 기질 특이성을 가지고 있어서 항바이러스제나 자살 유전자 치료에 이용되는 acyclovir와 gangciclovir와 같은 nucleoside analog의 효능을 일으키게 한다. 이의 활성을 증진시키기 위해 78%의 동일성을 갖는 HSV-1, HSV-2의 TK 유전자를 가지고 family shuffling올 하 였을 때, 각 단계에서 활성이 증가된 mutant를 얻었다.
654개의 clone을 4개의 성질 - 231에 서의 활성, 열안정성, 유기용매 안정성, pH 영향성-에 대해 조사하였다. 종종 효소의한 성질을 향상시키면 다른 성질은 떨어지는 경우가 있었는데 본 연구에서는 molecular breeding 이 이러한 점을 극복하고 좋은 성질만을 조합시킬 수 있는가 를 알아보기 위한 것을 목적으로 하였으므로 654개의 clone 을 5가지 조건에서 활성을 측정한 결과 모든 기존의 효소보다 뛰어난 mutant를 얻을 수 있었다. 이는 molecular breeding 이 자연계에서 쉽게 존재할 수 없는 두 가지 이상의 유익한 성질을 한 克소 안에 조합시킬 수 있는 방법임을 제시한다

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