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문제 정의
- 본 연구에서는 AFBi에 의한 돌연변이 유발을 억제하는 들 깨의 효과를 조사하였다(Table 3). Aflatoxin Bi(AFB)은4s pergillusflavuss\ A.
- 지금까지 들깨의 생리 활성 효과는 대부분 aTinolenic acid 와 관련된 것이었다. 본 연구에서는 들깨의 지질 이외의 성분 중에서 생리활성효과를 살펴보려고 하였으며 특히 들깨에 함유된 식 이 섬 유소의 생 리 활성 효과를 관찰하여 들깨의 영 양적 우수성을 밝히고자 하였다. 이에 들깨의 수용성 및 불용 성 식이 섬유소의 함량과 이들의 항돌연변이 효과를 조사하 였으며 들깨의 methanol 추출물, hexane 추출물 및 methanol soluble; fraction을 분리 하여 항돌연변이 효과를 검 토하 였으므로 이를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 들깨의 지질 이외의 성분 중에서 생리활성효과를 살펴보려고 하였으며 특히 들깨에 함유된 식 이 섬 유소의 생 리 활성 효과를 관찰하여 들깨의 영 양적 우수성을 밝히고자 하였다. 이에 들깨의 수용성 및 불용 성 식이 섬유소의 함량과 이들의 항돌연변이 효과를 조사하 였으며 들깨의 methanol 추출물, hexane 추출물 및 methanol soluble; fraction을 분리 하여 항돌연변이 효과를 검 토하 였으므로 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 수용성 식이 섬유소 : 여과액과 residue를 씻은 물 10 mL를 불용성 식이 섬유소 측정과정으로부터 얻어서 물로 50 g까 지 조정 하고, 60"C의 95% ethanol 200 mL를 첨 가해서 실온 에서 침전물이 형성되도록60분동안 방치시켰다. 이러한en zymc digest를 새로운 cellite를 힘-유흔! 1G3 여 과용 유리 도가 니 에 부은 후 78% ethanol 30 mL, 95% ethanol 10 mL, acetone 10 mL순으로 residue를 씻 고 105℃에서 overnight로 유리 도 가니흘 건조시 켰다- 2개의 시료 중 1개는 단백칠 함량을 측정 하였고 또 다른 1개의 시료는 회분량을 측정하였다.
- Maron과 Ames(21)의 방법에 따라 Sprague-Dawley rat 의 간을 적출하여 S9을 만들었으며 이 S9 fraction 1(M)을 MgCl-KCl salts(2%), 1 M glucose-6-phosphate (0.5%), 1 M NADP(4%), 0.2 M phosphate buffer(pH 7.4) 및 멸균수와 혼합하여 S9 mixture를 조제 하였다. S9 mix 0.
- Ames 박사로부터 제공받아 실험에 사용하였으며 실험 전 histidine 요구성 , deep rough(加) 돌 연변이, uurB 돌연변이. R factor 등의 유전형질을 확인하였다. 돌연변이 유발물질로 사용한 aflatoxin %(AFBi)은 미국 Sigma 회사에서 구입하여 DMSO에 녹여 실험에 사용하였 고, N-methyl-N'-nilro-N-nitrosoguanidine(MNNG)는 미 국 Aldrich 회사로부터 구입하여 증류수에 녹여 사용하였다.
- 시료 중량의 20배의 메탄올로3회 추출하여 메탄올 추출물 을 얻은 다음 농축한 후 DMSO에 녹여서 실험에 사용하였다. 또한 들깨 분말시료 50 g에 1 L의 헥산을 첨가하여 8시 간씩 3회 교반하고 여 과, 농축하여 헥산 추출물 (hexane extract)을 얻었으며, 이 렇 게 탈지 된 들깨 분말 50 g당 메 탄을 1 L를 첨 가 하여 2분간 고속으로 균질화하고 90분간 가열한 후 여 과하고 농축하여 메 탄올용해 추출물(methanol soluble fraction, MSF) 을 얻어서 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다(19, 20).
- 먼저 들깨 추출물에서 Salmonella typhimurium TA100에 대한 독성 실험을 행하여 시료에 의해 독성이 나타나지 않는 범위의 양으로 항돌연변이 실험을 행하였다.
대상 데이터
- R factor 등의 유전형질을 확인하였다. 돌연변이 유발물질로 사용한 aflatoxin %(AFBi)은 미국 Sigma 회사에서 구입하여 DMSO에 녹여 실험에 사용하였 고, N-methyl-N'-nilro-N-nitrosoguanidine(MNNG)는 미 국 Aldrich 회사로부터 구입하여 증류수에 녹여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 들깨 종자는 밀양 농업 시 험소에서 재 배 수확된 것으로 품종은 엽실들깨 (Yeupsil Perillafrutescens) 였다.
- 사용된 발암물질은 간접 발암물질인 3-amino-l-methyl- 5H-pyrido[4, 3-b] indoIe(Trp-P-2)이 었다.
- 사용한 균주는 Salmonella typhimurium TA100으로 미국 캘리포니 아 대학의 B.N. Ames 박사로부터 제공받아 실험에 사용하였으며 실험 전 histidine 요구성 , deep rough(加) 돌 연변이, uurB 돌연변이. R factor 등의 유전형질을 확인하였다.
이론/모형
- 들깨의 볼용성 식 이 섬 유소와 발암불질과의 결합능은 Mor- ctomi와 Mutai(23)의 방법에 따라 측정하였다. 즉 03 mL의 Trp-P-2오].
- 불용성 식 이 섬 유의 carcinogen binding 효과를 알아보기 위한 HPLC와 liquid scintillation counter를 사용한 여러 연 구들이 있다(29-32). 본 실험 에서는 Morotomi와 Mutai(23) 의 방법에 따라 돌연변이 유발억제 효과를 검토하였으며 그 원리는 HPLC와 liquid scintillation counter와 유사하다. Trp- P-2는 300℃ 정도로 태운 고기 에서 발견되는 강한 돌연변이 원으로(33) 들깨의 불용성 식 이 섬유소의 결합능을 살펴보 기 위하여 돌연변이 물질로 사용하였다.
- 식 이 섬 유소의 정 량분섭을 위한 시료는 들깨를 분쇄 하여 petroleum ether로 탈지 시 켜 조제하였다. 불용성 식 이 섬 유소 와 수용성 식 이 섬 유소의 양은 Prosky 등(17)의 방법에 따라서 정량하였다.
성능/효과
- Table 4는 hexane 추출물과 MSF에 대한 항돌연변 이 효과를 살펴본 결과이다. Hexane 추출물을 0.625 mg/assay 첨가한 경우에 AFB 에 대해 11%의 돌연변이 억 제 효과를 나타 내었고 1.25 mg/assay에서는 21%, 2.5 mg/assay에서는 20% 의 돌연변 이 억 제 효과를 나타내 어 hexane 추출물은 AFBi 의 돌연변이성 에 비교적 약한 억제효과를 보였다. 한편 MSF 의 경우 Q625 mg/assay 첨가로 73%의 돌연변이 억 제효고]-를 나타내 었으며 1.
- 한편, 들깨의 용매 추출물의 함량을 Table 2에 나타내었다. Methanol 추출물은 들깨 건조물의 8.0%이었으며 hexane 추 출물은 60.0%, MSF는 4.5% 함유되어 있어 hexane 추출물의 수율이 가장 높게 나타났다. 이것은 들깨에 40% 이상 함유된 지방 성분이 hexane에 의해 추출되었기 때문으로 생각된다.
- 5 mg/assay 첨가하였을 때 돌연변이 억제효과가 거의 나타나지 않았다. SDF의 경우에도 L25 mg/assay에서 17% 의 항돌연변이 작용을 나타내었을 뿐 0.625 mg/assay와 2.5 mg/assay의 농도에서 돌연변이 억 제효과는 보이지 않았다. 동일 농도에서 hexane 주줄물에도 돌연변이 유발에 대한 저 해효과가 없었으며 MSF는 0.
- 5 mg/assay 첨 가군 에서 각각 91%와 87%의 억제효과를 나타내었다. 그러나 같은 농도에서 SDF의 첨가군은 억 제효과가 나타나지 않았고 hexane 추출물은 20%의 억 제 효과를 나타내었다. 한편 직접 돌연변이원인 MNNG를 돌연변이원으로 사용한 경우에 항 돌연변이 효과는 크게 나타나지 않았다.
- 5 mg/assay의 농도에서 돌연변이 억 제효과는 보이지 않았다. 동일 농도에서 hexane 주줄물에도 돌연변이 유발에 대한 저 해효과가 없었으며 MSF는 0.625 mg/assay에서 13%, 1.25 mg/assay에서 18%, 그리고 2-5 mg/assay에서 27%의 돌연 변이 익제효과를 나타내었다. 이상의 결과로써 들깨 추출물온 직접 돌연변이원인 MNNG보다 간첩 돌연변이원인 AFB] 에 의해 유도된 돌연변이를 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 이러한 AFBie 돌연변이 유발원일 뿐만 아니라 강력한 발암원2로 알려져 있다(26). 들깨의 methanol 추출물을 0.625 mg/assay 첨가하였을 때 대조군에 비하여 38%의 돌연변이 억제효과를 나타내었고 1.25 mg/assay 첨가군은 75%, 2.5 mg/assay 첨가군은 91% 의 돌연변이 억제효과를 나타내었다. 그러나 들깨의 수용성 식 이 섬 유소를 같은 농도로 첨 가하였을 때는 methanol 주줄 물과는 달리 항돌연변이 효과를 나타내지 않았다.
- 5 mg/assay 첨가군은 27% 의 저 해 율을 보였을 뿐 methanol과 hexane 추출물 첨 가군은 억 제효과를 나타내지 않았다. 따라서 들깨의 용매 추출물은 간접 돌연변이원에 의한 돌연변이성을 억제시키는 것을 알 수 있었다. 또한 불용성 식 이 섬유소의 경우 Trp-A2에 의해 유발된 돌연변이를 다소(13~18%) 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 2%를 나타내었다. 또한 불용 성과 수용성 식이 섬유소를 합하여 전 체적으로 식이 섬유소 의 양은 17.2%이 며 들깨의 건조 중량으로는 18.2%를 나타내었다.
- 따라서 들깨의 용매 추출물은 간접 돌연변이원에 의한 돌연변이성을 억제시키는 것을 알 수 있었다. 또한 불용성 식 이 섬유소의 경우 Trp-A2에 의해 유발된 돌연변이를 다소(13~18%) 억제하는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 들깨의 불용성 및 수용성 식이 섬유소의 함 량을 축정 하였으며 들깨의 methanol 추출물, hexane 추출물, MSF 및 식 이 섬유소를 추출하여 항돌연변이 효과를 관찰하 였다冬 들깨의 총 식이 섬유소의 함량은 신선물인 경우 17.2% 였고 건조물인 경우 18.2%였으며 이 가운데 94%가 불용성 식 이 섬 유소였다, 들깨의 용매 추출물 중에서 methanol 추출 물과 MSF는 AFB에 의해 유발된 돌연변이를 상당히 억 제 시 켰으며 methanol 추출물과 MSF를 2.5 mg/assay 첨 가군 에서 각각 91%와 87%의 억제효과를 나타내었다. 그러나 같은 농도에서 SDF의 첨가군은 억 제효과가 나타나지 않았고 hexane 추출물은 20%의 억 제 효과를 나타내었다.
- 한편 Lee 등(27, 28)은 간접돌연변이원을 이용한 경우와 달리 직집 돌연변이원인 MNNG오]T-NQ。에서 케 일 및 대두를 비롯하여 당근, 시금치, 브로콜리, 콩나물, 된장의 수용성 식이 섬유소는 돌연변이 억제효과가 나타나지 않았으며 수용성 식 이 섬 유소의 성 분인 polydextrose, pectin, guar gum, carrageenan (0.5 mg/plate)도 항돌연변이 효과를 나타내지 않 '았다고 보고하여 돌연변이 억제작용이 모든 돌연변이원에 동일하게 나타나지 않는다는 것을 알 수 있다.
- MNNG는 Salmonella ty- phimurium TA1535와 TA100에 대한 대표적인 돌연 변이 유 발물질로 S9 mixture를 필요로 하지 않는 직접 돌연변이원 이다(26). 이러한 MNNG를 사용한 결과 AFBi에 비해서 항 돌연변이 효과가 낮게 나타났디즉 methanol 추출물을 0.625 -2.5 mg/assay 첨가하였을 때 돌연변이 억제효과가 거의 나타나지 않았다. SDF의 경우에도 L25 mg/assay에서 17% 의 항돌연변이 작용을 나타내었을 뿐 0.
- 25 mg/assay에서 18%, 그리고 2-5 mg/assay에서 27%의 돌연 변이 익제효과를 나타내었다. 이상의 결과로써 들깨 추출물온 직접 돌연변이원인 MNNG보다 간첩 돌연변이원인 AFB] 에 의해 유도된 돌연변이를 억제하는 것을 알 수 있었다. 따라서 들깨 추출물은 간에서 microsomal 효소계의 활성화에 관 여하여 돌연변이 전구 물질을 최종 돌연변이 물질로의 전환 을 억제하였거나 활성화된 돌연변이 물질에 직접 반응하여 제거할 것으로 사료된다- 또한 들깨의 용매 추출물과 수용성 식이 섬유소의 항돌연변이 효과는 MSF에서 가장 강하게 나 타나고로 들깨의 항돌연변이 활성물질이 이 추출물에 많이 존재할 것으로 생각된다.
- 한편 직접 돌연변이원인 MNNG를 돌연변이원으로 사용한 경우에 항 돌연변이 효과는 크게 나타나지 않았다. 즉 SDF를 1.25 mg/ assay 첨가한 군은 17%, MSF 2.5 mg/assay 첨가군은 27% 의 저 해 율을 보였을 뿐 methanol과 hexane 추출물 첨 가군은 억 제효과를 나타내지 않았다. 따라서 들깨의 용매 추출물은 간접 돌연변이원에 의한 돌연변이성을 억제시키는 것을 알 수 있었다.
- 5 mg/assay에서는 20% 의 돌연변 이 억 제 효과를 나타내 어 hexane 추출물은 AFBi 의 돌연변이성 에 비교적 약한 억제효과를 보였다. 한편 MSF 의 경우 Q625 mg/assay 첨가로 73%의 돌연변이 억 제효고]-를 나타내 었으며 1.25 mg/assay 및 2.5 mg/assay 첨 가시 87% 의 돌연변이 유발이 억제되어 hexane 추출물과는 달리 항돌 연변이 효과가 강한 것으로 나타났다. 들깨유가 rat에서 대장 암과 유방암을 억 제하며 (8) 들깨유에서 가장 함량이 높은 a - linolenic acid가 암세포 증식 억 제 작용을 가진다(5, 6)고 보고 되 었으나 본 연구에서는 지 방성 분이 주로 추출된 헥산추출 물이 메 탄올 추출물이 니-MSF에 비하여 돌연변이 억 제 작용 이 낮게 나타났다.
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