본 연구는 들깨 새싹 추출물의 항산화, 항염증 및 항부종에 대한 효과를 조사하였다. 들깨 새싹 추출물은 DPPH와 ABTS 라디칼을 효과적으로 제거하는 항산화 활성이 우수하였다. 또한 들깨 새싹 추출물은 활성화된 설치류 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 유래 HMC-1 세포의 TNF-${\alpha}$와 IL-$1{\beta}$를 효과적으로 억제하였다. 더욱이 마우스의 귀와 발 부종을 억제하는 우수한 효과가 있었다. 이러한 결과는 들깨 새싹 추출물은 항산화제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 항염증과 항부종에 효과적인 물질이라는 것을 제시해주었다. 이와 관련된 들깨 새싹 추출물의 기능성에 대해서는 앞으로 분자생화학적 수준에서 더 연구해야할 필요성이 있는 것으로 사료된다.
본 연구는 들깨 새싹 추출물의 항산화, 항염증 및 항부종에 대한 효과를 조사하였다. 들깨 새싹 추출물은 DPPH와 ABTS 라디칼을 효과적으로 제거하는 항산화 활성이 우수하였다. 또한 들깨 새싹 추출물은 활성화된 설치류 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 유래 HMC-1 세포의 TNF-${\alpha}$와 IL-$1{\beta}$를 효과적으로 억제하였다. 더욱이 마우스의 귀와 발 부종을 억제하는 우수한 효과가 있었다. 이러한 결과는 들깨 새싹 추출물은 항산화제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 항염증과 항부종에 효과적인 물질이라는 것을 제시해주었다. 이와 관련된 들깨 새싹 추출물의 기능성에 대해서는 앞으로 분자생화학적 수준에서 더 연구해야할 필요성이 있는 것으로 사료된다.
We investigated the effects of an ethanol extract from Perilla frutescens sprouts (PFSE) as an antioxidant, and its effects on edema and inflammation in RAW 264.7 cells and HMC-1 cells. The antioxidant activities (DPPH and ABTS radical scavenging) of PFSE were similar to those of butylated hydroxyto...
We investigated the effects of an ethanol extract from Perilla frutescens sprouts (PFSE) as an antioxidant, and its effects on edema and inflammation in RAW 264.7 cells and HMC-1 cells. The antioxidant activities (DPPH and ABTS radical scavenging) of PFSE were similar to those of butylated hydroxytoluene (BHT) and (${\pm}$)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox). We also investigated the anti-inflammatory effects of PFSE on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells and HMC-1 cells stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) with the calcium ionophore A23187. TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ production, which had been increased by treatment with LPS or PMA plus A23187, were significantly inhibited by PFSE in a dose-dependent manner. Furthermore, PFSE significantly reduced the xylene-induced ear edema and the carrageenan-induced paw edema of ICR mice in a dose-dependent manner. The effects of PFSE (200 mg/kg) in reducing ear and paw edema were similar to those of aspirin (50 mg/kg). These results suggest that PFSE can be potentially used as a medicine for treating oxidative stress, an edematous and inflammatory disease.
We investigated the effects of an ethanol extract from Perilla frutescens sprouts (PFSE) as an antioxidant, and its effects on edema and inflammation in RAW 264.7 cells and HMC-1 cells. The antioxidant activities (DPPH and ABTS radical scavenging) of PFSE were similar to those of butylated hydroxytoluene (BHT) and (${\pm}$)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox). We also investigated the anti-inflammatory effects of PFSE on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells and HMC-1 cells stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) with the calcium ionophore A23187. TNF-${\alpha}$ and IL-$1{\beta}$ production, which had been increased by treatment with LPS or PMA plus A23187, were significantly inhibited by PFSE in a dose-dependent manner. Furthermore, PFSE significantly reduced the xylene-induced ear edema and the carrageenan-induced paw edema of ICR mice in a dose-dependent manner. The effects of PFSE (200 mg/kg) in reducing ear and paw edema were similar to those of aspirin (50 mg/kg). These results suggest that PFSE can be potentially used as a medicine for treating oxidative stress, an edematous and inflammatory disease.
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문제 정의
7 세포와 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 와 calcium ionophore A23187로 동시에 자극한 인간유래 비만세포(mast cells)주인 HMC-1 세포에서 TNF-α와 IL-1β의 억제 효과를 조사하였다. 더불어 마우스 부종에 대한 PFSE의 억제 효과를 조사하여 매우 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구는 들깨 새싹 추출물의 항산화, 항염증 및 항부종에 대한 효과를 조사하였다. 들깨 새싹 추출물은 DPPH와 ABTS 라디칼을 효과적으로 제거하는 항산화 활성이 우수하였다.
제안 방법
PFSE가 TNF-α와 IL-1β 염증성 사이토카인의 억제능을 확인하기 위하여 PMA와 A23187로 동시에 자극하여 HMC-1 세포의 상층액을 대상으로 사이토카인을 측정하였다.
PFSE를 대상으로 ABTS 라디칼 소거 활성을 알아보기 위해 항산화제로 잘 알려진 Trolox와 비교하여 조사하였다. 그 결과 Fig.
PFSE를 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 알아보기 위해 합성 항산화제로 잘 알려진 BHT와 비교하여 조사하였다. 그 결과 Fig.
각 추출물과 Trolox의 최종농도가 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000 µg/mL이 되도록 정량하여 50 µL에 준비된 ABTS 용액 950 µL를 첨가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 732 nM에서 흡광도를 측정하였다.
각각의 군에 PFSE를 경구투여하고 30분 후 1% carrageenan을오른쪽 뒷다리에 100 µL를 발바닥 표면으로 해서 피부내로 주입하고 1시간 후 발바닥의 두께를 측정하였다.
각각의 군에 PFSE를 경구투여하고 30분 후 귀에 xylene을 20µL씩 도포하였다.
그러므로 본 연구는 들깨 새싹 추출물(P. frutescens sprout ethanol extract, PFSE)을 대상으로 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)와 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) 라디칼 소거 활성을 조사한 후 lipopolysaccharide (LPS)로 활성화된 설치류 유래 RAW 264.7 세포와 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 와 calcium ionophore A23187로 동시에 자극한 인간유래 비만세포(mast cells)주인 HMC-1 세포에서 TNF-α와 IL-1β의 억제 효과를 조사하였다.
한편 설치류에서 xylene (29), carrageenan (30) 유도 급성 염증 모델은 일반적으로 널리 사용되고 있는 실험방법이다. 그러므로 본 연구에서 PFSE가 염증에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위하여 xylene이나 carrageenan을 도포하거나 주입하기 30분전에 PFSE (50, 100, 200 mg/kg)를 구강 투여하고 한 시간 후 무게 및 두께를 조사하였다.
다음은 PFSE를 대상으로 carrageenan으로 유도된 발 부종의 억제 효과를 알아보기 위해서 aspirin과 비교하여 조사하였다. 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 carrageenan에 의해 발의 두께가 상당히 증가하였지만, PFSE를 구강 투여한 군에서는 대조군에 비해 발의 두께가 감소하였다.
각각의 군에 PFSE를 경구투여하고 30분 후 귀에 xylene을 20µL씩 도포하였다. 도포가 완료된 후 1시간 뒤에 직경 9.0 mm의 ear punching으로 마우스의 귀 조직을 떼어내어 무게를 측정하였다.
먼저 PFSE를 대상으로 xylene으로 유도된 귀 부종의 억제 효과를 알아보기 위해서 대조 약물인 aspirin과 비교하여 조사하였다. 그 결과 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 xylene에 의해 귀 조직의 무게가 상당히 증가하였지만, PFSE를 구강 투여한 군에서는 귀 조직의 무게가 감소하였다.
발아조건은 모두 조명을 밝히고 20-25℃ 범위에서 습도가 충분히 유지되도록 하여 발아 시킨 후 길이 생장이 촉진되도록 암 조건으로 옮겨 10-17일간 생육시켰다.
사이토카인의 측정은 PFSE나 aspirin을 2시간 동안 전 처리한 후 LPS (1 µg/mL)로 RAW 264.7 세포를 자극한 후 18시간 후에 상층액을 취하였고 PMA (30 ng/mL)와 A23187 (10 µM)로 동시에 HMC-1을 자극하여 12시간 배양 후 상층액을 취하여 TNF-α 와 IL-1β 측정에 사용하였다.
세포(2×105 cells/mL)는 24 well 배양 플라스크에 접종하여 약 70% 성장이 도달 되었을 때 PFSE, aspirin을 처리하고 염증성 사이토카인을 측정하였다.
시료를 MeOH로 녹여 최종 농도가 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000 µg/mL이 되도록 정량하여 96 well plate에 각 시료를 100 µL을 주입하고, 동시에 0.3 mM DPPH 100 µL를 넣어 총량이 200 µL가 되도록 하였다.
요약하면, 세포상층액 100 µL를각각의 항체가 코팅된 plate에 주입하고 반응시킨 후 잘 세척한 다음 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체를 주입하고 반응 시킨 후 발색 기질을 주입하고 반응시켜 ELISA reader로 측정하였으며, 각 물질에 대한 정량은 각각의 물질을 농도별로 처리하여 반응시켜 표준곡선을 정하고 세포 상층액에 함유된 물질의 양을 계산하였다.
이러한 염증 매개물을 억제할 수 있는 PFSE의 효과를 알아보기 위하여 먼저 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포를 대상으로 TNF-α와 IL-1β 생성량을 조사하였다(Fig. 2).
1주일의 순화기간을 거친 후 무작위로 군을 배정한 다음 실험에 사용하였다. 즉, ICR 마우스 50마리를 무작위로 나누어 대조군, PFSE군(각 50, 100, 200 mg/kg)과 aspirin군(50 mg/kg), 즉 5그룹으로 나누었다. 실험동물은 전 실험기간 동안 고형사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였으며, 사육환경 온도 23±3 ℃, 밤낮주기(12시간)가 조절되는 환경에서 사육하였으며 전주대학교 실험동물위원회의 실험 규정에 준하여 실행하였다.
RPMI Medium 1640, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS)는 Invitrogen사(Carlsbad, CA, USA)에서 구매하였고, tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin-1β (IL-1β) ELISA kit는 BD Bioscience (SanDiego, CA, USA)에서 구입하였다.
귀 및 다리의 부종 실험에 사용할 동물모델 제작에 필요한 실험동물은 무균환경에서 사육된 6주령 수컷 ICR 마우스로 중앙실험동물(Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 1주일의 순화기간을 거친 후 무작위로 군을 배정한 다음 실험에 사용하였다.
들깨(P. frutescens) 새싹의 재배는 황숙기에 채종하여 정선한 들깨의 종자를 4℃의 저온저장고에서 2-10개월 동안 저장한 다음 각각의 종자는 2시간 동안 증류수에 침지한 후 70% 에탄올로 30초 동안 소독하여 상토에 파종하였다. 발아조건은 모두 조명을 밝히고 20-25℃ 범위에서 습도가 충분히 유지되도록 하여 발아 시킨 후 길이 생장이 촉진되도록 암 조건으로 옮겨 10-17일간 생육시켰다.
설치류 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), penicillin G (100 IU/mL)와 streptomycin (100 µg/mL)이 첨가된 RPMI 1640 배지(GIBCO-BRL, Invitrogen Co., Grand Island, NY, USA), 인간 유래 비만세포주인 HMC-1 세포는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 2-mercaptoethanol (50 µM), penicillin G (100 IU/mL), streptomycin (100 µg/mL)이 첨가된 DMEM 배지(GIBCO-BRL, Invitrogen Co., Grand Island, NY, USA)를 사용하였다.
인간의 비만세포주인 HMC-1은 (재)전주생물소재연구소(Jeonju, Korea)로부터 분양받았고, 설치류 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rocknille, MD, USA)으로부터 구입했다.
데이터처리
모든 실험값은 평균±표준편차로 표시하였으며, 통계분석은 SPSS Statistics (version 20) Program을 이용하여 ANOVA와 Student’s t-test로 처리하였으며, 유의성 한계는 p<0.05로 정하였다.
500 µg/mL 농도에서 Trolox는 90.4±1.2로 매우 높게 나타났고 PFSE 역시 79.4±2.1%로 우수한 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였고, 1,000 µg/mL의 PFSE 는 같은 농도의 Trolox와 같은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다.
그 결과 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 xylene에 의해 귀 조직의 무게가 상당히 증가하였지만, PFSE를 구강 투여한 군에서는 귀 조직의 무게가 감소하였다. PFSE를 50 mg/kg을 구강 투여한 군과 대조군에서는 유의적인 차이는 없었지만 농도가 증가 할수록 부종의 억제 효과가 증가하였다. 대조군과 비교하여 100 mg/kg에서는 34.
PMA와 A23187 처리군과 비교하여 50 µg/mL에서는 26.6%(p<0.05), 100µg/mL에서는 36.9%(p<0.01), 200 µg/mL에서 48.4%(p<0.01)의 억제 효과가 있었다.
TNF-α와 함께 PMA와 A23187의 자극에 의해 증가되는 염증성 사이토카인인 IL-1β TNF-α와는 다르게 50 µg/mL에서도 PMA 와 A23187 처리군과 비교하여 유의적인 차이가 있었다.
그 결과 Fig. 1과 같이 31.25 µg/mL의 저농도에서는 21±1.4%로 낮았으나, 농도가 증가할수록 그 활성이 증가되었고 500 µg/mL 농도에서 82.3±2.1%로 최대의 DPPH 라디칼 소거 활성을 보여 합성항산화제로 알려진 BHT와 비슷한 효능을 나타냈다.
그 결과 Fig. 1과 같이 31.25 µg/mL의 저농도에서는 8.4±2.1%로 낮았으나, 농도가 증가할수록 그 활성이 증가되었다.
먼저 PFSE를 대상으로 xylene으로 유도된 귀 부종의 억제 효과를 알아보기 위해서 대조 약물인 aspirin과 비교하여 조사하였다. 그 결과 아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 xylene에 의해 귀 조직의 무게가 상당히 증가하였지만, PFSE를 구강 투여한 군에서는 귀 조직의 무게가 감소하였다. PFSE를 50 mg/kg을 구강 투여한 군과 대조군에서는 유의적인 차이는 없었지만 농도가 증가 할수록 부종의 억제 효과가 증가하였다.
대조군과 비교하여 100 mg/kg에서는 34.61%(p<0.05), 200 mg/kg에서는 44.87%(p<0.01) 의 억제 효과가 있었다.
대조군과 비교하여 100 mg/kg에서는 38.18%(p<0.05), 200 mg/kg에서는 47.27%(p<0.01)의 억제 효과가 있었다.
본 연구는 들깨 새싹 추출물의 항산화, 항염증 및 항부종에 대한 효과를 조사하였다. 들깨 새싹 추출물은 DPPH와 ABTS 라디칼을 효과적으로 제거하는 항산화 활성이 우수하였다. 또한 들깨 새싹 추출물은 활성화된 설치류 유래 대식세포주인 RAW 264.
또한 농도가 높아질수록 유의적으로 IL-1β 생성이 억제되었다.
들깨 새싹 추출물은 DPPH와 ABTS 라디칼을 효과적으로 제거하는 항산화 활성이 우수하였다. 또한 들깨 새싹 추출물은 활성화된 설치류 유래 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 인간 유래 HMC-1 세포의 TNF-α와 IL-1β를 효과적으로 억제하였다. 더욱이 마우스의 귀와 발 부종을 억제하는 우수한 효과가 있었다.
먼저, TNF-α의 경우에는 시료농도 50 µg/mL에서 LPS 처리군과 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 농도가 높아질수록 TNFα의 생성이 억제되었다.
먼저, TNF-α의 경우에는 시료농도 50 µg/mL에서 LPS 처리군과 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 농도가 높아질수록 TNF-α의 생성이 억제되었다.
더욱이 마우스의 귀와 발 부종을 억제하는 우수한 효과가 있었다. 이러한 결과는 들깨 새싹 추출물은 항산화제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 항염증과 항부종에 효과적인 물질이라는 것을 제시해주었다. 이와 관련된 들깨 새싹 추출물의 기능성에 대해서는 앞으로 분자생화학적 수준에서 더 연구해야할 필요성이 있는 것으로 사료된다.
2). 이러한 결과로부터 PFSE는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포로부터 염증을 매개하는 사이토카인 생성을 효과적으로 억제하는 결과를 나타냈다.
Aspirin은 PFSE에 비해 개선효과가 좋았지만 PFSE의 최종농도인 200 µg/mL에서는 aspirin과 비슷한 수준의 효과를 나타냈다. 이러한 결과로부터 PFSE는 PMA와 A23187로 자극된 HMC-1 세포로부터 염증을 매개하는 사이토카인 생성을 효과적으로 억제하는 결과를 나타냈다(Fig. 3).
아무것도 처리하지 않은 대조군에서는 carrageenan에 의해 발의 두께가 상당히 증가하였지만, PFSE를 구강 투여한 군에서는 대조군에 비해 발의 두께가 감소하였다. 즉, Fig. 4의 귀 부종 억제 효과와 같이 PFSE 50 mg/kg를 구강 투여한 군과 대조군에서는 유의한 차이가 없었지만 농도가 증가할수록 부종의 억제 효과가 증가하였다. 대조군과 비교하여 100 mg/kg에서는 38.
후속연구
BHT와 Trolox 같은 합성 항산화제는 세포의 대사 및 호흡작용을 방해하며 발암성 및 독성이 강하다는 문제점이 보고되고 있어 부작용이 없는 대체 천연 항산화제의 개발이 필요하다(22). 그러므로 본 연구 결과 PFSE의 우수한 항산화 효과는 천연 항산화제로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
지금까지 들깨를 이용한 연구로는 항산화나 항염증에 대한 연구(15,16)가 주로 이루어져 왔으나 들깨 새싹 추출물을 대상으로 항산화 효과와 항염증 그리고 부종 억제에 대해 연구한 결과는 없는 실정이다. 들깨 새싹에서의 기능은 아직까지 알려지지 않았기 때문에 이 품종을 대상으로 그 기능을 연구할 필요가 있다. 특히 들깨 새싹은 세포벽이 얇아 함유된 영양소의 배출이 용이하여 인체 흡수가 빠른 장점이 있다.
그러므로 염증반응을 억제하기 위해서는 비만세포의 활성을 차단하는 물질이 필요하다. 본 연구 결과 PFSE는 활성화된 비만세포의 염증 매개물을 억제시키는 우수한 효과가 있어 비만세포의 활성화에 따른 염증성 질환의 개선 또는 치료에 활용될 수 있는 소재라 사료된다.
이러한 결과는 들깨 새싹 추출물은 항산화제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 항염증과 항부종에 효과적인 물질이라는 것을 제시해주었다. 이와 관련된 들깨 새싹 추출물의 기능성에 대해서는 앞으로 분자생화학적 수준에서 더 연구해야할 필요성이 있는 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
들깨는 무엇인가?
들깨(Perilla frutescens)는 우리나라에서 오래전부터 재배해온 작물로 꿀풀과(Laviatae)에 속하는 일 년생 초본이다. 들깨는 종자용과 엽채용으로 나뉘는데 종자는 들깨유, 차, 죽, 제과 등에 사용되며 엽채는 신선채소, 절임, 통조림 등에 이용되고 있다 (13,14).
종자용 들깨는 어디에 사용되는가?
들깨(Perilla frutescens)는 우리나라에서 오래전부터 재배해온 작물로 꿀풀과(Laviatae)에 속하는 일 년생 초본이다. 들깨는 종자용과 엽채용으로 나뉘는데 종자는 들깨유, 차, 죽, 제과 등에 사용되며 엽채는 신선채소, 절임, 통조림 등에 이용되고 있다 (13,14). 지금까지 들깨를 이용한 연구로는 항산화나 항염증에 대한 연구(15,16)가 주로 이루어져 왔으나 들깨 새싹 추출물을 대상으로 항산화 효과와 항염증 그리고 부종 억제에 대해 연구한 결과는 없는 실정이다.
들깨 새싹은 재배과정에서 어떤 것을 피할 수 있기 때문에 건강을 위협할 요소가 줄어드는가?
특히 들깨 새싹은 세포벽이 얇아 함유된 영양소의 배출이 용이하여 인체 흡수가 빠른 장점이 있다. 또한 재배과정에서 비료 및 농약을 피할 수 있어 건강을 위협할 요소가 줄어든다(17-19). 들깨 새싹은 일반 성숙 채소 보다 종자가 발아되면서 아미 노산, 지방산, 탄수화물 등 영양성분의 변화와 함께 비타민, 무기질 그리고 폴리페놀 등 항산화 효과를 나타내는 물질의 함량이 종자 및 성숙기에 비해 높아 생리활성 물질이 증대되는 것으로 알려져 건강 기능성 생리활성물질의 함량이 높아 건강기능성 식품으로 인정받고 있다(17,18).
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