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문제 정의
- 본 연구는 개 동결정액제조 시 Tris-buffer에 RJ의 첨가 여부가 융해 후 동결정자의 생존성과 장 시간 생존성에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하기 위하여 실시하였다. 정액채취는 2마리의 Japan ese Spitzs(2~4세)를 이용하여 수압법에 의해 실시하였으며, 3분획 중에 2차 분획의 정자를 채취하였다.
- 본 연구에서는 동결보존 시 Tris-buffer에 Equex STM Paste와 RJ 첨가가 동결융해 후 정자의 생존율과 체외배양 시 생존기간에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하였다.
제안 방법
- Ⅱ 및 Ext. Ⅱ-RJ를 1시간에 걸쳐 천천히 첨가하여 glycerol 평형을 유도하였다. 동결을 위한 정자의 최종농도는 약 50x106cells/ml로 조정하였다.
- 1 및 1%의 RJ 가 첨가된 Ext. Ⅱ-RJ에서 동결정액의 제조 후 생존율을 조사하기 위하여 70℃ 온수에서 6초간 급속융해를 실시하였다. 융해된 정자의 생존율은 융해 후 즉시 및 1시간 후에 각각 조사한 결과는 Table 2와 같다.
- I으로 희석된 정액은 5℃ cold room에서 약 2시간 정도 냉각을 유도하여 5℃까지 냉각시킨 후 같은 용량의 Ext. Ⅱ를 약 1시간에 걸쳐 희석을 시켜 평형을 유도하였다. 평형 후 정액의 최종농도를 50 X 106 cells/ml 농도로 조정한 후에 0.
- Tris-buffer에 적당한 RJ의 첨가농도를 알아보고자 Ext. Ⅱ에 다양한 농도를 첨가하여 개의 정액 동결을 실시하였다. Equex STM paste만이 첨가된 Ext.
- 5ml straw에 주입하여 Styrofoam box에 LN2 gas에 의해 예비동결 후 액체질소에 침적하여 동결을 완료하였다. 동결정액 의 융해는 38 °C에서 1분간 또는 70°C에서 정확하게 6초간 각각 실시하였다. 융해 후 모든 정액은 각 실험에서 운동성과 장시간 생존성을 평가하였다.
- 동결정액의 융해 후 정자의 활력도와 생존성을 검사하기 위하여 융해는 70℃ 온수에 약 6초간 실시하였다. 융해정자의 평가는 38℃로 조절된 warm plate 위에서 Wildt 등(1988)의 방법에 준하여 운동성 및 전진운동성(0 = 운동성 전혀 없음; 5 = 지속적이고, 급속하게 전진운동성)을 평가하였다.
- 융해정자의 평가는 38℃로 조절된 warm plate 위에서 Wildt 등(1988)의 방법에 준하여 운동성 및 전진운동성(0 = 운동성 전혀 없음; 5 = 지속적이고, 급속하게 전진운동성)을 평가하였다. 또한 체외에서 장시간 생존율을 조사하기 위하여 융해 후 38℃ water bath에 저장하면서 융해 직후, 1,2 및 3시간 때에 1시간 간격으로 정자의 생존성도 위와 같은 방법으로 평가하였다.
- 동결정액 의 융해는 38 °C에서 1분간 또는 70°C에서 정확하게 6초간 각각 실시하였다. 융해 후 모든 정액은 각 실험에서 운동성과 장시간 생존성을 평가하였다. 1% Ext.
- 1%RJ를 Ext Ⅱ에 첨가하는 것이 융해 후 생존율과 1시간 후 생존율에 가장 효과적인 것으로 판단되었다. 이후의 실험에서는 RJ 첨가군에서는 0.1% RJ 를 첨가하여 실시하였다.
- 공시축은 순천대학교 동물사육장의 애견사육실에서 물과 사료를 자유급식시키면서 독립 cage에 각각 사육하였 다. 정액은 2~3일 간격으로 주당 2회씩 마사지법으로 채취하였다(Fougner, 1989). 개의 사정은 three fraction으로 사정하기 때문에 sperm-rich fraction인 2nd fraction의 정액을 채취하였다.
대상 데이터
- Ⅱ 및 Ext. Ⅱ-RJ를 제조하여 이용하였다. 희석된 정액은 냉장실에서 5°C까지 2시간에 걸쳐 냉각시켰으며 또한 5℃까지 냉각된 Ext.
- 동결정액제조를 위하여 정액채취는 2~4세의 Ja panese Spitzs 수캐 2두를 공시하였다. 공시축은 순천대학교 동물사육장의 애견사육실에서 물과 사료를 자유급식시키면서 독립 cage에 각각 사육하였 다.
- 본 연구는 개 동결정액제조 시 Tris-buffer에 RJ의 첨가 여부가 융해 후 동결정자의 생존성과 장 시간 생존성에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하기 위하여 실시하였다. 정액채취는 2마리의 Japan ese Spitzs(2~4세)를 이용하여 수압법에 의해 실시하였으며, 3분획 중에 2차 분획의 정자를 채취하였다. 사출정액은 400xg로 5분동안 원심분리 후 2ml Tris-buffer로 희석하였다.
이론/모형
- 동결정액의 융해 후 정자의 활력도와 생존성을 검사하기 위하여 융해는 70℃ 온수에 약 6초간 실시하였다. 융해정자의 평가는 38℃로 조절된 warm plate 위에서 Wildt 등(1988)의 방법에 준하여 운동성 및 전진운동성(0 = 운동성 전혀 없음; 5 = 지속적이고, 급속하게 전진운동성)을 평가하였다. 또한 체외에서 장시간 생존율을 조사하기 위하여 융해 후 38℃ water bath에 저장하면서 융해 직후, 1,2 및 3시간 때에 1시간 간격으로 정자의 생존성도 위와 같은 방법으로 평가하였다.
성능/효과
- 1)가 Ext. Ⅱ(1h: 42.5±12.6; 2h: 27.5±17.1; 3h: 20.0±12.1)보다 유의적으로 높았다 (P<0.05).
- Ⅱ-RJ 희석액으로 동결보존 후 38℃에서 1분간 또는 70℃에서 6초간 융해 후 조사한 결과는 Table 3과 같다. 급속간이동결 후 융해시 급속융해(70℃ 에서 6초간)와 완만융해(38℃에서 1분간)의 경우 융해직후(81±3.1 및 77.5±9.6)에는 차이가 없었으나, 1시간 경과 후(68.8土12.5 및 48.8±16.3)에는 급속융해가 유의적으로 높은 생존율을 보였다(P<0.05).
- 난황과의 상호작용은 활성분자들의 용해화에 관련이 있을 수 있다는 가설은 단지 상층액이 완충액의 준비에 사용되었을 때만 관찰됨으로써 지지받았고, SDS를 원심분리전에 난황에 첨가하는 것이 후에 첨가하는 것보다 융해 후 운동성에 매우 효과적인 영향을 미쳤다고 보고하였다(Penfold와 Moore, 1993). 본 연구에서 0.1%RJ를 Ext Ⅱ에 첨가하는 것이 융해 후 생존율과 1시간 후 생존율에 가장 효과적인 것으로 판단되었다. 이후의 실험에서는 RJ 첨가군에서는 0.
- 1)보다 융해 후 1, 2 및 3시간째에 유의적으로 높은 운동성을 보여 Equex STM paste를 첨가하는 것이 효과적이었다고 보고하였다. 본 연구의 결과에서는 급속동결융 해방법을 이용하여 RJ첨가 여부에 따른 융해 직후, 1, 2 및 3시간경과에 다른 생존율을 조사한 결과 0.1% Ext. H-RJ 와 Ext.
- 05). 비록 38°C와 70°C에서 융해직후생존성에는 차이가 없었지만, 융해 후 1시간째의 정자의 생존성은 38°C(48.8±16.3)에서 보다 70°C(68.8土 12.5)에서 유의적으로 높았다. 또한 비록 융해 직후에는 0.
- Anderson 방법은 LN? vapour에 의한 급속동결 과 70°C에서 8초간 급속융해를 실시하는 간이급속 동결 및 융해방법인 반면에 CLONE 방법은 LN? tank에서 goblet의 높이를 낮추면서 동결속도를 조절하는 완만동결과 37°C에서 15초간 융해 후 3TC 희석액에 5분간 정치 후 조사하는 완만동결 및 융해방법이다. 즉, 완만동결방법은 융해 후 정자의 운동성과 시간이 경과하면서 운동성이 급속동결방법보다 급속하게 떨어지는 경향을 보였다. 또한 Rota등 (1997)은 egg yolk-tris-glycerol(EYT-G)와 EYT -G에 Equex STM paste를 첨가(YET-GE)한 희석액으로서 동결 후, 융해즉시, 1, 2 및 3시간 후에 운동성을 조사한 결과 EYT-GE(61.
후속연구
- U-RJ를 이용한 개의 동결정액 제조를 실시할 경우 이들의 보합효과 (synergic effect)를 얻은 결과로 판단된다. 또한 이러한 동결정액 희석액을 이용하여 제조한 동결정액으로 개의 인공수정에 응용한다면 융해 후 체외에서 정자의 장시간에 걸쳐 운동성을 가짐으로써 정자와 난자가 만날 수 있는 가능성, 즉 수정 가능성을 동시에 높일 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구결과는 Tris-buffer에 0.1% RJ첨가한 동결정액 희석액(0.1% Ext. Ⅱ-RJ)은 개 동결정액의 융해 후 생존성과 장시간 생존성에 효과적이며, 또한 이러한 희석액을 이용한 동결정액 제조로 인공 수정에 이용한다면 정자와 난자의 수정율을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.
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