[논문]Tris-buffer에 첨가되는 당의 종류가 동결.융해정자의 첨체 손상에 미치는 영향

유대중; 공일근

Tris-buffer에 첨가되는 당의 종류가 동결.융해정자의 첨체 손상에 미치는 영향
Effect of Sugar Kind Added in Tris-buffer on Acrosome Damage of Post-thaw Spermatozoa in Canine 원문보기

韓國受精卵移植學會誌 = Korean journal of embryo transfer, v.18 no.2, 2003년, pp.91 - 96

유대중 (순천대학교 농업생명과학대학 동물자원과학과) , 공일근 (순천대학교 농업생명과학대학 동물자원과학과)

초록
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본 연구는 개의 동결정액제조 시 동결보호 희석액 내에 첨가되는 당의 종류와 조합이 동결융해 후 정자 두부의 첨체의 손상과 생존율 및 운동성 등에 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다. 당의 종류에 따른 정자의 첨체손상 정도는 정상 정자비 율은 Fru+Tre, 처리구가 Fructose, Trehalose, Fru+Tre+Xyl, Fru+Xyl, Tre+Xyl, Xylose구에 비해 가장 높았다(83.0$\pm$5.6%, 82.3 $\pm$3.1%, 81.7$\pm$2.1%, 81.0$\pm$5.6%, 80.3$\pm$4.5%, 76.7$\pm$3.8%, 72.0$\pm$2.0%;(P<0.05). Fru+Tre처리구에서 CASA 분석 후 운동성이 Fru +Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose구에 비해 가장 높았다. (79$\pm$6 vs 75$\pm$3, 74$\pm$8, 71$\pm$11, 70$\pm$4, 66$\pm$15, 63$\pm$12%; P< 0.05). 전진운동율은 Fru+Tre 처리구가 Fru+Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose구에 비해 가장 높았다(67$\pm$7, 64$\pm$3, 62$\pm$6, 61$\pm$8, 60$\pm$2, 57$\pm$13, 53$\pm$10%; P<0.05). 본 연구결과 70 mM Fru+Tre (two combination) 가 첨체 손상정도가 낮았으며 가장 높은 운동성 및 전진 운동율의 결과를 얻을 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was conducted to evaluate the effect of sugar kinds and combination of various sugars on acrosome damage of post-thaw spermatozoa in canine. The extender used in this study was Tris-citric acid extender (Tris-buffer) supplemented with 20% Egg-yolk, 8% glycerol, 1% Equex STM paste, and 70 mM sugars such as monosaccharide (fructose and xylose) and disaccharide(trehalose). To evaluate of sugar combination, the sugars supplemented in Tris-buffer were combined such as control (fructose, xylose, trehalose), two combinations (Fru+Tre, Fru+Xyl, Tre+Xyl) and three combinations (Fru+Tre+Xyl). The acrosome damage rate of post-thaw spermatozoa in Eosin B & Fast Green stain in Fruc+Tre was higher than those in fructose, trehalose, xylose, Fruc+Xyl, Tre+Xyl, Fruc+Tre+Xyl (83.0$\pm$5.6 vs. 82.3$\pm$3.1%, 81.7$\pm$2.1%, 72.0$\pm$2.0%; 80.3$\pm$4.5%, 76.7$\pm$3.8%, 81.0$\pm$5.6). The motility after CASA analysis in Fru+Tre was higher than those in Fru+Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose(79$\pm$6 vs 75$\pm$3, 74$\pm$8, 71$\pm$11, 70$\pm$4, 66$\pm$15, 63$\pm$ 12%). However, the progressive motility after CASA analysis in Fru+Tre group was higher than those in Fru+Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose (67$\pm$7, 64$\pm$3, 62$\pm$6, 61$\pm$8, 60$\pm$2, 57$\pm$13, 53$\pm$10%). The results indicated that the acrosome damage & progressive motility of post-thaw spermatozoa in 70 mM Fruc+Tre (two combination) following Eosin B & Fast Green stain and CASA analysis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 control (fructose, xylose, trehalose), two combination (Fruc+Tre, Fruc+Xyl, Tre+Xyl) 및 three combination (Fruc+Tre+Xyl)으로 구분하여 Tris-buffer에 첨가하여 개의 동결정액의 융해 후 정자의 첨체 손상율 및 운동성에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 조사하였다.
본 연구는 개의 동결정액제조 시 동결보호 희석액 내에 첨가되는 당의 종류와 조합이 동결융해 후 정자 두부의 첨체의 손상과 생존율 및 운동성 등에 미치는 영향에 대하여 조사하고자 실시하였다.

제안 방법

Rota 등 1996). 개의 동결정액 제조를 위한 희석액은 Tris-citric acid extenders] 기본용액에 20 % Egg-yolk, 4% glycerol, 0.5% Equex STM paste등을 첨가하였으며, 당성분으로는 monosaccharide (fructose 및 xylose) 및 disaccharide (trehalose)로구분하여 최종 70mM의 농도로 첨가 이용하였다. 희석액에 당의 첨가는 정자의 융해 후 활력 도에 유의적인 영향을 미친다고 보고하였다(Aslan 등,1992; Garcia와 Graham, 1989).
semen analysis : Hamilton)를 이용한정액의 운동성을 조사하였다(농협 유우개량사업소). 검사정액의 경우 10 ㎕를 microcell slide에 넣고 검사를 시행하였으며, 조사항목은 MOT(운동 정자 비율, %), PROG(전진운동정자비율, %), VAP (정자의 초당 평균이동속도, pm/sec), VCL(정자의 초당 평균곡선이동속도, ㎛/sec), VSL(정자의 초당 평균 직선 이동속도, ym/sec), ALH(측두거리, tan) 등으로 정액의 운동성을 종합적으로 조사 평가하였다.
동결융해 후 현미경을 통한 육안검사보다는 정확하고 객관적인 평가가 가능한 CASA (Compu- ter-asssisted semen analysis : Hamilton)를 이용한정액의 운동성을 조사하였다(농협 유우개량사업소). 검사정액의 경우 10 ㎕를 microcell slide에 넣고 검사를 시행하였으며, 조사항목은 MOT(운동 정자 비율, %), PROG(전진운동정자비율, %), VAP (정자의 초당 평균이동속도, pm/sec), VCL(정자의 초당 평균곡선이동속도, ㎛/sec), VSL(정자의 초당 평균 직선 이동속도, ym/sec), ALH(측두거리, tan) 등으로 정액의 운동성을 종합적으로 조사 평가하였다.
48), 삼투압y(280, 1, 370 mOsm/kg)로 조정되었다. 원정액의 정자수 (농도), 활력과 생존율 등을 조사하여 동결정액 제조의 가능 여부를 판단하여 동결이 가능한 정액을Ext I 으로 희 석 하여 5 ℃ cold room 에서 2시 간 정도 방치하여 5℃까지 냉각시켜 같은 온도의 동량 Ext II를 약 1시간에 걸쳐 희석, 평형을 유도하였다. 평형 후 최종농도가 50X105 6 cells/ml 되게 조정 후 0.
첨체 검사는검사전 가온판에 Slide glass와 기본염색액을 38℃ 로 가온시킨 다음 38℃, 1분간 융해한 정액을Sperm washing media를 이용하여 400 Xg/5 분간 2회 실시한 이후 원심분리 이후 얻어진 Semen pellet 10 ㎕ 와 가온된 기본염색 액을 1:2의 비율로 Mix한 이후 38℃ 조건에서 5분간 정치시킨 이후 미리 가온된 슬라이드에 Mix sol.을 10 를 도말하여 가온판에서 건조시킨 후 Inverted microscope 를 이용 l, 000x에서 염색된 정자의 100개를 3 반복하여 검경하였으며 정상 첨체의 정자를 백분율로 표기하였다.
정액채취는 18〜24개월령의 종견을 월 1〜2회씩 수압법을 통하여 실시하였다. 정액 채취시 외부로부터 채취된 정액이 직사광선 손상을 피할 수 있고 채취된 정액이 온도충격을 피할 수 있으며, 종견이 외부로부터 심리적인 자극을 최소화할 수 있는 정액채취실내의 정액 채취대에서 실시하였다.
정액채취는 음경을 마사지하여 발기와 돌출을유도하여 돌출된 음경의 구선부위(Bulbus glandis)를 잡고 압력을 가하면서 무리한 수압으로 인한 혈관의 파열을 피하면서 음경을 발기시켜 종 견의 성적 자극을 유도하여 채취하였으며 2차 fraction(sperm-rich fraction) 만을 SPECIMEN CUP (녹십자)을 이용하여 사정되는 정액을 채정하였고 정상적인 정액만을 택하여 채취된 정액을 38℃로 보정된 보온병에 옮겨 정자의 온도충격을 피하면서 원심분리기를 이용 400 xg로 약 5분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 상층액이 제거된 Semen pellet 의 10 yl 를 1 〜2 ml 의 Sperm washing media에 희석하여 정자의 농도를 검사하였고 나머지 semen pellet의 경우 미리 준비된 Ext I으로 옮긴 다음 본 연구에 사용하였다.
실험에 사용하였다. 정자농도의 측정은 원심분리 이후 분리된 Semen pellet중 10 “1를 Sperm Washing Media에 100x 희석하여 Micro Pippette 를 이용 충분히 Mix한 이후 Haemacytometer (Ma- rienfeld GERMANY)에 10 “1 를 적하하여 Inverted Microscope 100x 상에서 정자의 농도를 검경하였다.
정자의 첨체검사는 Eosin B & Fast green을 기본염색 액으로 이용하여 실시하였다. 첨체 검사는검사전 가온판에 Slide glass와 기본염색액을 38℃ 로 가온시킨 다음 38℃, 1분간 융해한 정액을Sperm washing media를 이용하여 400 Xg/5 분간 2회 실시한 이후 원심분리 이후 얻어진 Semen pellet 10 ㎕ 와 가온된 기본염색 액을 1:2의 비율로 Mix한 이후 38℃ 조건에서 5분간 정치시킨 이후 미리 가온된 슬라이드에 Mix sol.
동결정액의 융해는 38℃에서 1분간 실시하고 가온판이 부착된 현미경 .하에서 정액의 활력과 생존율을 검사하고 CASA 검사 및 정자의 첨체로 정액의 운동성 및 정자두부의 첨체손상 정도를 평가하여 인공수정 이용 여부를 판단하였다

대상 데이터

수압법을 통하여 실시하였다. 정액 채취시 외부로부터 채취된 정액이 직사광선 손상을 피할 수 있고 채취된 정액이 온도충격을 피할 수 있으며, 종견이 외부로부터 심리적인 자극을 최소화할 수 있는 정액채취실내의 정액 채취대에서 실시하였다. 수압법을 통한 정액 채취전 선처리 과정의 경우 음경 포피 부위의 털을 가위 등을 이용하여 제모하여 정액 채취시 이 물질의 혼입을 막았으며, 음경포피 부위에 잔존되어 있는 이물질을 70% 에틸알콜에 소독되어진 티슈를 이용하여 제거하였다.
정액채취와 동결정액 제조를 위해 공시되는 개의 경우 경기도 평택시 소재 애견 농장에서 선발된 종견을 순천대학교의 농장에서 물과 사료를 자유 급식시키면서 사육하였다. 공시견은 중 .
정자의 생존율 및 운동성은 채취된 원심분리 이전 원정액에서 10 M를 분리하여 warm plate를 이용 38 ℃ 상에서 Inverted Microscope# 이용하여검경한 후 생존율이 >80% 이상인 개체의 정액을 본 실험에 사용하였다. 정자농도의 측정은 원심분리 이후 분리된 Semen pellet중 10 “1를 Sperm Washing Media에 100x 희석하여 Micro Pippette 를 이용 충분히 Mix한 이후 Haemacytometer (Ma- rienfeld GERMANY)에 10 “1 를 적하하여 Inverted Microscope 100x 상에서 정자의 농도를 검경하였다.

이론/모형

4. 동결정액 제조를 위한 희석액 제조 및 동결처리

동결정액제조를 위한 Tris-buffer^- Rota 등 (1997)의 방법에 준하여 제조하였다. 이렇게 제조된 Ext T , II 의 최종 pH (6.
이상의 연구에서 얻어진 결과는 SAS Dunkan package(l999)에 의하여 분석하였다.

성능/효과

특히 전진운동율과 정자의 첨체의 이상 비율은 수정율과 유의성이 매우 높은 관계로서 전진운동율과 정상정자의 첨체비율이 가장 높은 Fru+Tre 처리구가 가장 효과적인 것으로 판단되었다. 1 당류인 fructose와 2당류인 trehalose의 혼합처리구가타처리구보다 정자의 정상첨체율과 전진운동율이높은 것은 2당류인 trehalose가 첨체손상율과 사멸정자율의 개선에, 1 당류인 fiuctose가 정상첨체율, 활력도 및 운동성까지 synergistic effect를 거두었다고 판단된다. 본 결과에서 1당류 또는 2당류 등의 단독첨가보다는 이들의 적절한 조합에 의한 첨가가 동결융해 정자의 첨체손상을 줄여주고 운동성을 높여주는 효과를 얻을 수 있는 것으로 판단된다.
Fru+Tre처리구에서 CASA 분석 후 운동성이 Fru+Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose구에 비해 가장 높았다.(79±6 vs 75±3, 74±8, 71±11, 70±4, 66±15, 63±12%; P< 0.
05). 또한 수정율과 유의성이 높은 전진운동율에 있어서도 Fru+Tre, Fru+Tre+ Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl 구가 Xylose, Trehalose, Fructose구보다 유의적으로 높았다(67±7, 64±3, 62±6, 61±8, vs 60±2, 57±13, 53±10%; P< 0.05).
1 당류인 fructose와 2당류인 trehalose의 혼합처리구가타처리구보다 정자의 정상첨체율과 전진운동율이높은 것은 2당류인 trehalose가 첨체손상율과 사멸정자율의 개선에, 1 당류인 fiuctose가 정상첨체율, 활력도 및 운동성까지 synergistic effect를 거두었다고 판단된다. 본 결과에서 1당류 또는 2당류 등의 단독첨가보다는 이들의 적절한 조합에 의한 첨가가 동결융해 정자의 첨체손상을 줄여주고 운동성을 높여주는 효과를 얻을 수 있는 것으로 판단된다.
본 연구결과 70 mM Fru+Tre (two combination)가 첨체 손상정도가 낮았으며 가장 높은 운동성 및 전진 운동율의 결과를 얻을 수 있었다.
CASA로 평가한 자료는 Table 2에서와 같다. 운동성은 Fru+Tre, Fru+Tre+Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl, 구가 Xylose, Trehalose, Fructose구보다 유의적으로 높았다(79±6, 75±3, 74±8, 71±11, vs 70±4, 66±15, 63±12%; PO.05). 또한 수정율과 유의성이 높은 전진운동율에 있어서도 Fru+Tre, Fru+Tre+ Xyl, Tre+Xyl, Fru+Xyl 구가 Xylose, Trehalose, Fructose구보다 유의적으로 높았다(67±7, 64±3, 62±6, 61±8, vs 60±2, 57±13, 53±10%; P< 0.
05). 전진운동율은 Fru+Tre 처리구가 Fru+Tre+Xyl, Tre Xyl, Fru+Xyl, Xylose, Trehalose, Fructose구에 비해 가장 높았다(67±7, 64±3, 62±6, 61±8, 60± 2, 57±13, 53±10%; P<0.05).
당의 종류에 따른 정자의 첨체손상 정도는 Table 1에서와 같다. 정상 정자비율은 Fru+Tre, Fr uctose, Trehalose, Fru+Tre+Xyl, 구가 Fru+Xyl, Tre +Xyl, Xylose보다 유의적으로 높았다(83.0±5.6, 82.3+3.1, 81.7±2.1, 81.0+5.6, vs 80.3±4.5, 76.7 ±3.8, 72.0 ±2.0). Yildiz 등(2000)은 정자의 운동성, 활력도 및 정상첨체율은 32℃에서 20〜30분간 평형 후 모든 처리구에서 유의적으로 감소하였다.
0). 특히 전진운동율과 정자의 첨체의 이상 비율은 수정율과 유의성이 매우 높은 관계로서 전진운동율과 정상정자의 첨체비율이 가장 높은 Fru+Tre 처리구가 가장 효과적인 것으로 판단되었다. 1 당류인 fructose와 2당류인 trehalose의 혼합처리구가타처리구보다 정자의 정상첨체율과 전진운동율이높은 것은 2당류인 trehalose가 첨체손상율과 사멸정자율의 개선에, 1 당류인 fiuctose가 정상첨체율, 활력도 및 운동성까지 synergistic effect를 거두었다고 판단된다.

후속연구

것으로 판단된다. 즉, 1당류가 할 수 있는 기능과 2당류가 할 수 있는 기능이 다르다면 이들을 적절한 비율로 혼합하여 첨가하는 것은 궁극적으로 동결융해 정자의 운동성, 활력도뿐만 아니라 정상첨체율을 향상시켜 이들 정자를 이용할 경우 수정에 성공할 가능성을 크켜 높일 수 있을 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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