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문제 정의
- 또한, 생산 및 품질관리 면에서 미생물 배양에 의한 당화합물의 생산은 천연물추츨에 의한 당화합물의 생산에 비해 더욱 안정적인 장점을 갖고 있다고 할 수 있다. 본 논문에서는 이 신규 미생물을 이용하여 면역활성에 의한 항암효과를 갖는 EPS를 생산 및 제조 방법 그리고 당화합물의 성분 및 물성, 면역활성에 의한 항암효과를 제시하고자 한다(11).
- 본 연구는 유근피(느릅나무 뿌리껍질)로부터 면역 활성에 의한 항암효과를 갖는 당화합물 개발에 관한 연구를 추행헤가는 과정에서 살아있는 느릅나무 뿌리껍질로부터 EPS를 생산하는 신규미생물을 분리한 데서 기인한다. 본 연구실에서는 이미 유근피로부터 수용성 단四다당체를 분리하여, 이의 면역 활성에 의한 항암효과를 검증한 바 있다(10).
제안 방법
- EPS의 면역활성에 의한 항암효능을 검증하기 위하여 B16 흑색종 이식 쥐를 이용하여 실혁하였다. 실험동물은 대한 실험동물센터(주)로부터 공급 받아 유지 관리되고 있는 특정 병원체 부재 주](암컷, 6주령, 18-22 g)를 사용하였다.
- EPS의 생체오] 면역활성 검정을 위해 면역세포 증식시험 (immune cell proliferation assay), 흔합림프엑 반응 (mixed lymphocyte reaction, MLR), 면역세포 분열촉진(direct milogenicity) 시험, T-cell 의존형 힝체생성(S vitro T-cell dependent antibody production) 능력측정을 실시하였으며, 생체내 면역활성에 외한 항암효과를 보기 위해 B16 혹색종 모델을 사용하였디..
- 1 정도의 산성을 나타내었는데, 이 부근에서 최데 점성을 보였으며 pH가 증가함에 따라 접성은 감소하는 경향을 보였다. EPS의 유번학적 성질은 1% 농도에서 Xanthan gum용액고]- 비교하여 살펴보았다. Figure 4는 전단속도의 변화에 따른 EPS 와 xanthan gum의 점성변호전단응력의 변화를 보여주고 있다.
- MYGP 배지의 고체 한천베지 상에 성장한 많은 콜로니 중에 세포밖 당화함물(EPS)을 생산하는 균주들 중 액체 배양을 통해 당화합물을 가장 많이 생산하는 균주를 별도로 선벌하여 동정음 실시하였다. Figure 1(a)는 최종저으로 선별된 균주를 다시 고체 한천 배지 상에 자라게 했을 때의 시-진으로 EPS가 생성되어 petri dish 뚜껑까지 EPS가 떨어져 나가 있는 것을 볼 수 있다.
- sp. SSYL(KCTC 0687BP)을 사용하여 세포밖 당 화합물(exopolysaccharide, EPS)을 생산하여, EPS 의 면역 활성에 의한 항암효과를 실험적으로 제시하였다. EPS는 종당함량이 43.
- 플라스크 상에서 Enterobacter sp. SSYL(KCTC O687BP)균주를 이용하여 12종의 탄소원에 대하여 EPS의 생산 여부를 조사하였다. 이 중 galactose가 가장 높은 생산성을 나타내었으며(추율 38%).
- 이후 30℃ 배양기에서 배양(이틀 동안) 해가면서 고체 한 친 베지 상의 다양한 콜로니 중에서 세포밖 다당류를 셍산하는 콜로니(colony)들을 분리하였다. 고체 한천배지에서 세포 밖 다당류를 생산하는 콜로니는 MYGP배지를 포함하는 액체 베지(100 mL)에서 30℃, 200 rpm의 조건으로 생산여부를 다시 확인하여 최종척으로 가장 높은 생산성을 보이는 균주를 분리하여, 동정에 들어갔다. 균주의 동정은 국세기탁기관인 셍멍공학연구원 유전사은행(KCTC)을 통하여 동정하였으며, 동정을 위한 시험법으로는 균체지방산 분석(MIDI), API 20E 검정, BIOLOG 검정, 16S rRNA 서열분석 등이 이용되었다.
- 점도 측정을 위해 S51 스핀들을 사용하였으며, 측정온도는 25 ℃ 였다. 그리고 0.5%(w/v) EPS 용액을 제조한 다음 산/염기를 첨가하여 pH를 변화시킨 후(2.68T1.5), pH 변화에 따른 점도 변화를 관찰하였다. 또한, EPS의 유변학적 성질을 알아보기 위해 1% 세포밖 다당류 용액과 1% xanthan gum 용엑의 전단속도(shear rate)의 변화에 따른 점성변화 및 전단응력(shear stress)의 변화를 알아보았다.
- 5), pH 변화에 따른 점도 변화를 관찰하였다. 또한, EPS의 유변학적 성질을 알아보기 위해 1% 세포밖 다당류 용액과 1% xanthan gum 용엑의 전단속도(shear rate)의 변화에 따른 점성변화 및 전단응력(shear stress)의 변화를 알아보았다. 본 실험을 위해서 Fluid Rheometer(ARES, Rheometric Scientific, Co.
- 면역활성에 의한 항암효과를 보기 위한 샘플제조를 위해 2 L 발효소(Marubishi Co. Ltd, Model MDL 6C)를 사용하여 다음 베지조성 및 배양조건에서 배양한 후 Scheme 1의 과정을 거쳐 세포밖 다당류를 생산하였다. 배지조성은 30 이L 탄 소원, 3 g/L malt extract, 3 압L yeast extract, 5 임I bactopeptone 이 사용되었다.
- 0 wm이었으며, pH는 별도로 조절하지 않고 하루 정도(24시간 이내) 베양하였다. 배양과정 중에서 글루코스를 기질로 사용한 경우 효소법(영동제약)에 의해 글루코스 농도 변화를 관찰하였으며, 시간에 따른 배양엑의 산화환원전위 (ORF) 변화도 관찰하였다. 배양후 초고속 원심분리기 (Sorvall RC 26 Plus, Rotor SLA-1500)를 이용해 12, 000 rprn, 20분 정도 조건에서 배양액으로부터 세포를 분리하였다.
- 하케 점도계 (Hakke viscometer)를 이용하여 수크로스(sucrose) 를 탄소원으로 했을 때 생산된 EPS의 농도별 점성을 측정하였다. 점도 측정을 위해 S51 스핀들을 사용하였으며, 측정온도는 25 ℃ 였다.
대상 데이터
- Ltd, Model MDL 6C)를 사용하여 다음 베지조성 및 배양조건에서 배양한 후 Scheme 1의 과정을 거쳐 세포밖 다당류를 생산하였다. 배지조성은 30 이L 탄 소원, 3 g/L malt extract, 3 압L yeast extract, 5 임I bactopeptone 이 사용되었다. 탄소원으로는 글루코스 (glus%), 수크로스 (sucrose), 프록토스(fructose), 갈락토오스(galactose), 글루코 네이트(gluconate), 자일로스(xylose), 아라비노오스(arabinose), 람노스(rhamnose) 등을 사용하였다.
- 살아있는 느릅나무의 뿌리를 체취(부산 김해근처 야산)하여 뿌리에 있는 홁음 털어낸 후 뿌리껍질을 벗겨서 이것을 잘게 자른 후, 믹서기로 증류수를 붓고 분쇄하였다. 이 과정에서 뿌리껍질에 있는 수용성 당화합물이 추출되면서 수용액은 끈끈해지게 되는데 이 끈끈한 액을 MYGP(malt extract 3 g/L; yeast ©xtm기 3 g/L, glucose 10 g/L, bactopeptone 5 g/L) 고체 한천배지에 조금 백금니로 도말(streaking)하였다.
- 이식 쥐를 이용하여 실혁하였다. 실험동물은 대한 실험동물센터(주)로부터 공급 받아 유지 관리되고 있는 특정 병원체 부재 주](암컷, 6주령, 18-22 g)를 사용하였다.
- 배지조성은 30 이L 탄 소원, 3 g/L malt extract, 3 압L yeast extract, 5 임I bactopeptone 이 사용되었다. 탄소원으로는 글루코스 (glus%), 수크로스 (sucrose), 프록토스(fructose), 갈락토오스(galactose), 글루코 네이트(gluconate), 자일로스(xylose), 아라비노오스(arabinose), 람노스(rhamnose) 등을 사용하였다. 발효조 배양조건은 온도 30℃, 250 rpm, 통기량 0.
이론/모형
- EP&의 총당함량은 페놀-황산법 (phenol-sulfuric method)을 사용하였으며, 산성당 함량은 카바졸법 (carbazole method)을, 단백질 함량은 개선된 로우리법(modified Lowry method)을 사용하여 측정하였다. 그리고, 세포밖 다당류의 당 구성 성분을 분석하기 위헤서는 HPLC를 사용하였다(14).
- 고체 한천배지에서 세포 밖 다당류를 생산하는 콜로니는 MYGP배지를 포함하는 액체 베지(100 mL)에서 30℃, 200 rpm의 조건으로 생산여부를 다시 확인하여 최종척으로 가장 높은 생산성을 보이는 균주를 분리하여, 동정에 들어갔다. 균주의 동정은 국세기탁기관인 셍멍공학연구원 유전사은행(KCTC)을 통하여 동정하였으며, 동정을 위한 시험법으로는 균체지방산 분석(MIDI), API 20E 검정, BIOLOG 검정, 16S rRNA 서열분석 등이 이용되었다.
- . 그리고, 녹성 검정을 위해서는 패혈성 쇼크 모델을 사용하여 확인하였다 (14).
- 또한, EPS의 유변학적 성질을 알아보기 위해 1% 세포밖 다당류 용액과 1% xanthan gum 용엑의 전단속도(shear rate)의 변화에 따른 점성변화 및 전단응력(shear stress)의 변화를 알아보았다. 본 실험을 위해서 Fluid Rheometer(ARES, Rheometric Scientific, Co.)를 사용하였다 (12).
성능/효과
- 이 결과로부터 생체 내 항암효과를 보기 위한 EPS의 처리농도는 3 ㎎/㎏ 이하로 하였다. Figure 9(a)는 0.3, 1, 3 tng/kg의 시료치리시 B16 흑색종 모델음 이용한 면역에 의한 항암효능을 측정한 것으로 주어진 농도에서 낮은 농도일수록 항암효과가 크게 나타났다. 이에 따라 Figure 9(b)와 같이 농도를 더 낮추어 0.
- 3, 1, 3 tng/kg의 시료치리시 B16 흑색종 모델음 이용한 면역에 의한 항암효능을 측정한 것으로 주어진 농도에서 낮은 농도일수록 항암효과가 크게 나타났다. 이에 따라 Figure 9(b)와 같이 농도를 더 낮추어 0.03, 0.1, 0.3 ㎎/㎏에 대해서 조사한 결과 0.3 ㎎/㎏ 일 떼 가장 강한 항암효과를 나타내었으며, 이 농도에서 약 138.1% 정도의 생존연장효과를 나타내었다. 이때 양성대조 물질인 아드리아마이신 (adriamycin) 의 경우 177.
- EPS의 면역활성 검정에 따르면 EPS 는 면역세포의 증식을 자극하는 mitogen역할을 히-며, 특히 T 세포에 의한 면역증강효과를 나타내었다. B16 흑색종 이식 마우스를 이용한 생체내 면역활성에 의한 항암효과를 관찰한 결과 유의성 있는 항암효과를 나타내었으며, 천연물인 유근피 추출 단비]다당체의 결과(3 ㎎/㎏에서 약 140%의 셍존연장효과를 보임)와 비교해 볼 때 1/10의 농도인 0.3 mg/1 磚에서 약 138.1%의 비슷한 항암효과를 나타내었다.
- EPS의 총당함량은 43.0% 내지 70.8%였으며, 총산성당 함량은 7.1% 내지 11.4%, 총단백질 함량은 19.3% 내지 20.6% 로, 느릅나무 뿌리껍질에서 분리된 신규미생물 에 의해 생성된 EPS는 당단백질임을 알 수 있었다. EPS의 당 구성성분을 보면 glucuronic acid(46.
- Figure 4는 전단속도의 변화에 따른 EPS 와 xanthan gum의 점성변호전단응력의 변화를 보여주고 있다. 결과를 보면 세포밖 다당류는 동일 농도에서 Xanthan gum과 비슷한 슈도플라스틱(Psuedoplastic) 유변학적 성질을 보여주고 있으며, 정상 점도(steady viscosity) 측면에서는 큰 차이를 나타내지 않았다.
- 농도 증가에 따른 점도 증가는 지수적인 증가를 나타내었다. 그리고, 0.5% 용액의 초기 pH는 4.1 정도의 산성을 나타내었는데, 이 부근에서 최데 점성을 보였으며 pH가 증가함에 따라 접성은 감소하는 경향을 보였다. EPS의 유번학적 성질은 1% 농도에서 Xanthan gum용액고]- 비교하여 살펴보았다.
- 물질로 추정되었다. 그리고, 1R과 ’H-NMR욜 사용하여 EPS흘 분식해보변 산성당을 포함하는 당화합물의 전형적인피크들을 보여주었다(data not shown).
- 2% 이상의 높은 생존연장 효과를 나타내었다. 또한, 투여 다음 날부터 14일간 체증의 변화를 2일 간격으로 관찰한 결과 약물처리 후 14일째까지 특별한 체중감소는 관찰되지 않았다(data not shown). Figure 10은 용매대조군에 대한 EPS 를 처리한 마우스의 사진을 보여주는 것으로 용매 대조군의 경우 암세포 증식이 과도하게 이루어진 것을 볼 수 있지만 단백 다당체의 경우 이러한 암세포증식이 상당히 억제되었음을 알 수 있다.
- Glycerol 배지의 경우셍산이 매우 적었으며, sorbitol의 경우는 세포성장은 이루어졌지만 EPS는 전혀 생산이 되지 않았디《data not shown). 많은 탄소원 중에서 EPS 생산을 위해서 상대적으로 값이 싼 glucose와 sucrose를 최종직으로 선택하였으며, 두 탄소원의 경우 생산된 EPS외 생제외 면역세포 증식시험 결과를 보면 비슷한 면역세포 증식 결과를 보여주었다. 탄소원에 대한 춰종 EPS의 수율은 10% 내외였다.
- 띠-라서, 발효조 내부의 상태변화와 관련하여 ORP를 측정변수 및 제어변수로 사용하는 것도 외미가 있다고 생각된다. 발효조를 통해 얻은 EPS의 최종 수율은 10% 내외로 플라스크 배양의 20% 내외의 수율에 비해서는 낮은 수윰을 나타내었다.
- Figure 1(a)는 최종저으로 선별된 균주를 다시 고체 한천 배지 상에 자라게 했을 때의 시-진으로 EPS가 생성되어 petri dish 뚜껑까지 EPS가 떨어져 나가 있는 것을 볼 수 있다. 이 균주를 생명공학연구원 유전자은행에 균주동정을 의리한 결과 切■속에 속하는 신규 균주로 동정되었고, 이후 특허 균주로 등록하였다. 균주명은 Enterobacier sp.
- SSYL(KCTC O687BP)균주를 이용하여 12종의 탄소원에 대하여 EPS의 생산 여부를 조사하였다. 이 중 galactose가 가장 높은 생산성을 나타내었으며(추율 38%). sucrose, glucose, xylose, gluconate 등에서도 생산이 높게 나타났다(수을 20% 내외).
- Figure 7(c)는 EPS의 in vitro T-dependent 항체 형성능력에 대한 실험결과로 MLR이나 direct mitogenicity 실험결과에 비해 낮은 활성을 보여 추었다. 이상과 같은 세포외 면역실험결과를 토대로 볼 때 느릅나무로부터 분리된 미생물에 의해 생산된 EPS는 면역세포의 증식을 유도하는 mitogen으로서의 기능을 갖고 있으며, 면역세포 중 B세포에 내한 면역반응보다는 T세포에 대한 년역반응을 더 강하게 유도하는 것으로 판단되며, 이러한 면역반응이 결국 항암효과를 유발한다고 추정한다.
- 본 연구실에서는 유근피와 살아있는 느릅나무 뿌리껍질 시.이의 생리활성을 비교 연구하는 과정에서 살아있는 뿌리껍질로부터 면역 활성을 나타내는 EPS를 생산하는 신규 미셍물을 분리하였으며, 국제기탁기관인 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)을 통하여 동정한 결고〕- Enterobactere^ 속한 신규미셍물로 검증되었다(특허 균주 등록번호: KCTC 0687BP).
- Figure 10은 용매대조군에 대한 EPS 를 처리한 마우스의 사진을 보여주는 것으로 용매 대조군의 경우 암세포 증식이 과도하게 이루어진 것을 볼 수 있지만 단백 다당체의 경우 이러한 암세포증식이 상당히 억제되었음을 알 수 있다. 전체적인 결과를 보면 EPS의 경우 천연물인 유근피 추출 단백다당체의 경우와 비슷한 면역활성능을 보여주었다(14). 유근피 추출 단배다당체의 경우 3 ㎎/㎏에서, EPS의 경우는 0.
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