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문제 정의
- 본 연구에서는 느릅나무davidiana)의 근피로부터 분리한 mansonone E의 항암효과에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 37 g를 얻었다. CH2C12 주출물 37g를 hexane/ethylacetate 혼합용매를 용출용매로 사용하여 stepwise gradient elution 방식으로 silica gel chromatography (0=3.0x50 cm)를 실시하여 18개의 분획으로 나누었다. 이 중 14번째 분획(7.
- 융점은 Haakebuchler 미량융점 측정기를 사용하여 측정하였으며 측정치는 따로 보정하지 않았다. 물질의 동정을 위하여 EI-MS (70 eV)는 JEOL 사의 JMS-DX 303 mass spectrometer, 1H 및 13C NMR spectn는 Brokere AM-300 및 AMX-500를 사용하였고, IR spectra는 FT-IR (Shimatsu, Japan)을 이용하여 측정하였다. Column charomatography는 silica gel 60 (70-230 mesh, Merk)를 사용하였고, prep.
- 이 capsule을 24시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 후, 마우스의 좌우 옆구리에 피하 이식하였다. 시료 투여 일로부터 8일 후에 마우스로부터 hollow fiber 캡슐을 적출하여 캡슐 내에 있는 세포농도를 MTT 시약(1 mg/ml)으로 염색한 후, 형성된 formazan를 DMSO로 녹여 흡광도(540 nm)를 측정하여 저해율로 평가하였다. Xenographic animal assay는 적정 농도의 암세포를 누드 마우스의 옆구리에 이식하여 종양을 만든 후, 형성된 종양을 clean bench에서 적출하여 가로, 세로, 높이를 3 mm 정도로 일정하게 절단하여 새로운 마우스의 옆구리에 절단한 종양을 이식하였다.
- 시료는 DMSO에 녹여 5, 10 및 20㎎/㎏의 농도로 복강으로 매일 1회씩 총5회 투여하였다.
- Xenographic animal assay는 적정 농도의 암세포를 누드 마우스의 옆구리에 이식하여 종양을 만든 후, 형성된 종양을 clean bench에서 적출하여 가로, 세로, 높이를 3 mm 정도로 일정하게 절단하여 새로운 마우스의 옆구리에 절단한 종양을 이식하였다. 이식 후, 종양의 크기가 200-300mm3 가 되는 시점부터 시료를 투여하였으며 항종양 효과의 판정은 투여 시작일로부터 28일째까지의 종양의 크기를 대조군과 비교하여 저해율로 평가하였다.
대상 데이터
- Column charomatography는 silica gel 60 (70-230 mesh, Merk)를 사용하였고, prep. HPLC는 GIGAPREP SK-1 (SHISEIDO, Japan)를 이용하였다. TLC plate는 silica gel 60F254 precoated plate (Merk)를 사용하였다.
- 실험에 사용한 대장암 세포로는 HCW5, Colo-320DM, WiDr와 HCT116을, 자궁암 세포로는 HeLa와 SiHa를 사용하였다.
- 실험재료 - 본 실험 재료에 사용한 느릅나무의 근피(楡根皮)는 한약 재료상으로부터 구입하여 사용하였으며, 표품은 건국대학교 동물자원연구센터에 보관되어 있다.
이론/모형
- 항암활성 평가 - 인간 암종을 위한 항암 스펙트럼은 Hollow fiber assay와 Xenographic animal assay를 이용하여 측정하였다.11,12)Hollow fiber assay는 암세포를 한쪽 끝이 봉인된 hollow hber에 주입한 후 나머지 한 쪽을 봉하여 macrocapsule를 만들었다.
성능/효과
- 6종류의 종양세포주에 대한 평가 결과, HeLa에 대하여 두 가지 검색법에서 일관된 항암활성이 나타났다. 즉, 20㎎/㎏ 농도에서 모두 50% 이상의 종양증식 저해효과를 나타내었으며 그 효과도 농도에 따라서 의존적으로 나타났다.
- 느릅나무 근피로부터 분리한 항암활성 성분의 여러 가지 기기분석 결과, IR 스펙트럼의 1695와 1645cmT의 흡수대는 > C=O와 CY에 기인한 것으로 판단되었고, EIMS 결과 [M+2] 의 ortho-naphthoquinone의 특징적인 ion peak가 관찰되었다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 8개의 proton signal이 관찰되어 2개의 aromatic proton으로 보이는 signal 8 7.
- UV λmax의 측정결과, 445 nm에서 ortho-naphtho-quinone의 특징적인 흡수파장 대가 관찰되었다. 따라서 느릅나무 근피의 methanol 추출물로부터 분리한 물질은 mansonone E(G5H14O3)로 판단되었으며 이 결과는 기존에 보고 된 문헌의 결과와 일치하는 것으로 나타났다.13-17)
- 본 연구결과, mansonone E는 in vivo 검색법인 hollow fiber assay 및 xenograft assay에서 대장암 및 자궁암 세포주에 대한 항암활성 평가결과, 마우스에 이식된 종양세포에 대하여 50% 증식저해효과를 나타내었다. 농도는 20㎎/㎏의 수준이었고, 이 농도에서 종양증식저해효과가 나타난 세포주는 10 ㎎/㎏ 농도에서 대략 30% 정도의 증식저해 수준을 나타내었다.
- 6종류의 종양세포주에 대한 평가 결과, HeLa에 대하여 두 가지 검색법에서 일관된 항암활성이 나타났다. 즉, 20㎎/㎏ 농도에서 모두 50% 이상의 종양증식 저해효과를 나타내었으며 그 효과도 농도에 따라서 의존적으로 나타났다. 감수성이 높은 순서로는 HeLaK>KWiDrK>KHCT-15로 나타났고, 나머지 종양세포주는 유의한 차이를 볼 수 없었다.
후속연구
- 본 연구결과로부터 느릅나무 근피의 methanol 추출물의 항암효과 물질은 mansonone E임을 알 수 있었으며, 향후 이 물질에 대한 pharmacocore의 확인 및 용해성 개선 등에 관한 연구가 필요하리라 생각된다
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