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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 대두와 두부제조 부산물인 비지 및 한국의 전통발효식품인 된장의 지질획분의 생리 활성기 능을 시험 하기 위하여 우선 지 질 을 추출한 다음 acetone으로 부분분획 하고 여러 종류의 암세포들에 대한 세 포독성 시 험을 하였으며 silicic acid column chromatography, silica gel TLC 및 densitometer 등을 이용하여 지 질획 분의 조성 을 비교하고 sphingolipid에 대한 연구를 위한 기초실험을 하였다.
- Sullards 등(24)은 대두의 glycosylceramide-i* 대 장균의 glucoceramidasee- 처리 하여 얻은 ceramidee]- 우유의 sphingomy이in으로부터 얻은 cer- amide보다 대장암세포인 HT29 cell의 apoptosis를 일으키는데 더 효과가 있었다고 하였다. 본 연구에서 된장의 발효 과정에서 대두에 함유되어 있는 glycosylceramide는 분해되어 함량이 감소하였지 만 그 대신 생성된 ceramide 또는 sphingosine, sphinganine, phytosphingosine 등이 세포에 직접적 인 생리활성을 가지기 때문에 대두 및 비지보다도, 7? 贝"。실험에서 암세포에 세포독성을 나타낼 수도 있었던 것으로 생각되며 대두 및 대두발효식품의 sphingolipid 조성 및 항암효과에 대한 연구를 진행하고 있다.
제안 방법
- Lipase, protease 등을 불활성 화시 킨 대 두, 비지 및 된장으로부터 추출한 지질에 과량의 아세톤을 가하여 침전된 분획(AP 분획)과 비 침 전분획 (AS 분획)을 농축 건조하고 용매 및 배양액을 이용하여 1 mg/mL 농도로 조제한 다음 96 well micropiate에서 단계별 회석하고 사람의 백혈암 세포주인 K562 세포, mouse의 백혈암 세포주인 Yacl 세포 및 mouse의 고형암 세포주인 sarcoma 180 세포에 대한 세포독성을 관찰한 결과는 Table 1, 2 및 3과 같았다. 대두의 지 질 획 분은 아세톤상층액(AS 획분)과 아세톤침전물(AP 획분) 모두 1 mg/mL 농도에서 실험에 사용한 모든 암세포들에 대하여 세포 독성을 나타내지 않았으나 비지의 경우 0.
- 항암효과가 있다고 하였다. Sphingolipid는 약알칼리에 가수분해되지 않으므로 약알칼리에 안정한 lipid를 분리하여 sphingolipid의 존재를 일부 하인하였다. 각 분획을 0.
- 2 N NH4OH (40 :10 :1), chloroform : methanol: water(60 : 35 : 8), chloroform :methanol: water(65 :12 : 2), chloroform : benzene : acetone(80 : 20 :10), chloroform : methanol: water(65 : 25 : 4) 및 chloroform : methanol: acetic acid(90 : 2 : 8) 등으로 전개한 후 발색시약을 분무하고 densitometer(Model GS-670, Bio-Rad, USA)로. scanning하여 비교하였다.
- 각 지 질시료에 다량 존재하는 glycerolipid를 가수분해하고 N-acyl lipid인 sphingolipid를 얻기 위하여 약염 기 용액으로 가수분해하였다. 즉, Folch 법으로 정제하고 acetone으로 분리 한 분획들(AP분획 및 AS 분획 )을 0.
- 총지질의 일부는 silicic acid column chromatography 방법으로 분획하였으며 각 분획들을 지질표준품과 함께 TLC로 전개하였고 발색시약들을 분무하여 지질을 확인하였다. 당지질을 검출하기 위하여는 orcinol-ferHc chloride-황산 시약 및 a -naphtol 시약을, 아미노지질은 1% ninhydrin/acetone 시 약을, 아미 드지 질은 차아염소산-benzidin 시 약을, 인지질은 molybden trioxide 및 molybden0] 함유된 Dittmer 시약을, sterol 지질 및 일반지질은50% 황산을 분무하여 100~ 120℃에서 가열한 다음 지질성분들을 확인하였다(21).
- 세포독성시험을 위하여 배양한 세포들을 phosphate buffered saline(PBS)로 세 척 한 다음 trypan blue액에 현탁하여 세포수를 센 다음 배양액으로 희석하였다. 대두 및 대두발효식품의 총지질을 아세톤으로 분획한 아세톤 침 전물(AP 분획 ) 및 아세톤상층액 (AS 분획 을 농축하여 용매를 제거한 후 소량의 chloroform 및 methanol을 이용하여 녹이고 DMEM 배양액으로 희석 하여 1 mg/mL 농도로 시료를 조제하였다. 96 well microplate에서 1 mg/mL 농도의 시 료를 단계 적 2배 희 석 법 으로 희 석 하고 시 료가 있는 microplate well 당 암세포를 4000 cell 되 게 넣은 다음 72시간 동안 배양하였다.
- 대두, 비지 및 된장의 지질을 아세톤으로 분획한 AP 분획과 AS분획의 지질조성을 비교하기 위하여 각 지질분획을 silica gel TLC plate 위에서 여러 혼합용매계로 분리하고 발색시약을 분무한 다음 105℃에서 건조하여 비교하였다. 단순지질 분리용 전개용매로 AS 및 AP 지질분획을 전개한 경우 Table4에서와 같이 된장지질에는 대두 또는 비지에 비하여 triglyceride는 22.
- 대두, 비지 및 된장의 총지질을 chk>roform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분을 얻었다. 된장지질의 AS 획분 및 AP 획분이 실험에 사용한 K562, Yacl 및 S180 암세포에 가장 강한 세포독성을 일으켰으며 비지의 AS 및 AP 획분 역시 된장보다는 약하지만 세포독성을 나타냈으나 대두의 지질획분들은 세포독성효과를 나타내지 않았다.
- 대두는 농협 에서 구입한 국산 대두콩 2 kg을 잘 닦은 다음 분쇄기로 갈아 가루를 만들었으며 비지는 부산시에 소재하는 동아식품에서 두부제조시 부산물인 생비지를 얻어 동결 건조하였고, 된장은 국산 대두콩으로 제조한 메주로 담아 1년간 숙성 시 킨 시료를 동결 건조한 후 분말화하였다. 모든 시 료들은 지질을 추출하기 전 autoclave에서 15분간 멸균하여 lipase 또는 protease 등의 효소를 불활성 화 시 킨 다음 실험 에 사용하였다.
- 대두식품들로부터 추출한 지 질분획들이 사람의 K562 백혈구암세 포, mouse의 Yakl 백 혈구암세포 및 S180 고형 암세포에 미치는 세포독성 효과를 MTT assay법으로 조사하였다. 대두, 비지 및 된장의 총지질을 chk>roform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분을 얻었다.
- 96 well microplate에서 1 mg/mL 농도의 시 료를 단계 적 2배 희 석 법 으로 희 석 하고 시 료가 있는 microplate well 당 암세포를 4000 cell 되 게 넣은 다음 72시간 동안 배양하였다. 세포독성을 관찰하기 위하여 PBS에 5mg/m丄되게 녹인 MTT[3-(4, 5 dimethyIthizol- 2-y 1) 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] 용액 20 uL씩 을 첨 가하고 匸}시 4시 간 동안 37℃에서 배양한 후 각 well당 10% SDS용액을 가하고 빛을 차광한 상태에서 하룻밤 실온에서 방치한 다음 흡광도는 microplate reader (model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정 하였다(19).
- 암세포에 대한 세포독성시험을 위하여 acetone 침전법으로 조단순지 질 및 조복합지 질로 분획 하였다. 즉, Folch 법으로 정제된 지질을 농축하여 소량의 chloroform : methanol(2 : 1)에 녹인 다음 20배 용량의 acetone을 가한 후 4℃에서 16시간 동안 놓아두어 그 침전물을 여과하고 농축하여 용매를 제거 흐t 다음 아세톤 비 가용분획 (AP : acetone precipitates) 및 아세톤 가용분획 (AS : acetone supernatants)으로 나누어 실험에 사용하였다.
- 조단순지 질 및 조복합지 질로 분획 하였다. 즉, Folch 법으로 정제된 지질을 농축하여 소량의 chloroform : methanol(2 : 1)에 녹인 다음 20배 용량의 acetone을 가한 후 4℃에서 16시간 동안 놓아두어 그 침전물을 여과하고 농축하여 용매를 제거 흐t 다음 아세톤 비 가용분획 (AP : acetone precipitates) 및 아세톤 가용분획 (AS : acetone supernatants)으로 나누어 실험에 사용하였다.
- 농축된 지질로부터 오염된 비지질획분을 제거하기 위하여 Folch법(20)으로 정제하였다. 총지질의 일부는 silicic acid column chromatography 방법으로 분획하였으며 각 분획들을 지질표준품과 함께 TLC로 전개하였고 발색시약들을 분무하여 지질을 확인하였다. 당지질을 검출하기 위하여는 orcinol-ferHc chloride-황산 시약 및 a -naphtol 시약을, 아미노지질은 1% ninhydrin/acetone 시 약을, 아미 드지 질은 차아염소산-benzidin 시 약을, 인지질은 molybden trioxide 및 molybden0] 함유된 Dittmer 시약을, sterol 지질 및 일반지질은50% 황산을 분무하여 100~ 120℃에서 가열한 다음 지질성분들을 확인하였다(21).
대상 데이터
- 3종류의 암세포, 즉 사람의 K562 leukemia cell, mouse의 Yacl leukemia cell 및 Sarcoma 180 cell을 10% fetal bovine serum 및 streptomycin, penicillin 등이 함유된 RPMI 1640 media에서 배양하였다. 세포독성시험을 위하여 배양한 세포들을 phosphate buffered saline(PBS)로 세 척 한 다음 trypan blue액에 현탁하여 세포수를 센 다음 배양액으로 희석하였다.
- 030. Experiments were performed in triplicate.
이론/모형
- 다음 여과액들을 합하여 농축하였다. 농축된 지질로부터 오염된 비지질획분을 제거하기 위하여 Folch법(20)으로 정제하였다. 총지질의 일부는 silicic acid column chromatography 방법으로 분획하였으며 각 분획들을 지질표준품과 함께 TLC로 전개하였고 발색시약들을 분무하여 지질을 확인하였다.
성능/효과
- 2A에서 나타난 바와 같이 fr. 1(chloroform : methanol=90 :10)의 경우 5% 황산용액의 분무시 대두에서 monoglycosylceramide의 Rf치와 비슷한 Rf=0.74에서 진한 spot을 볼 수 있었으나 된장에서 는 glycosylceramide는 감소한 반면 ceramide(Rf= 0.88)가 증가한 것으로 나타났다. 같은 조건으로 전개한 TLC 에 1%의 ninhydrin용액을 분무하였을 때 된장지질획분에서는 Rf=0.
- 본 실험에서는 총지질을 중성지질, 당지질 및 인지질로 분리하지 않은 혼합지질상태에서 복합지질 전개용매를 사용하여 TLC를 행 하였으므로 농도%를 정확하게 계산할 수 없었으나 여러 종류의 발색 시약을 분무하여 지 질의 조성을 비교할 수 있었다. Fig. 1A에서와 같이 痘 -naphtol-황산용액에 의하여 보라색으로 발색된 당지질을 비교해보면 대두 및 비지에서는 acylsterylglycoside(Rf=0.75), sterylglycoside(Rf= 0.55), glycosylceramide(Rf=0.53, 0.48), sulfoglycosyl ceramide (sulfatides, Rf=0.30), unknown glycolipid(Rf=0.16) 등이 발견되었으나 된장의 경우 acylsterylglycoside 및 sterylgly- coside는 사라지지 않았고 glycosylceramide는 많이 감소하였으며 낮은 위치의 당지질 spot들은 거의 보이지 않았다. Front line 및 그 위쪽에 나타난 커다란 반점은 혼합용매로 올리기 전에 미리 ether로 끝까지 전개하여 나타난 중성지질들이다.
- 18)을 발견할 수 있었다. Fig. ID는 amide 또는 2급아민을 가진 지 질을 나타내는 녹색바탕에 노란 반점으로 대두와 비지의 AP 획분에서는 phosphatidylethanolamine(Rf=0.39), sulfphoglycosylcer- amide(Rf=3.0) 및 Rf=0.16인 미지의 물질이 풍부하였으나 된장의 경우 AP 및 AS획분에서는 많이 감소한 것으로 나타났다. 이와 같이 된장이 대두 및 비지와는 달리 phosphatidyl ethanolamine 또는 sulfphoglycosylceramide 등의 물질이 감소된 것은 오랜 기 간 발효숙성 되는 과정에서 자가효소 및 미 생물에 의하여 발효되는 과정에서 복합지질들이 가수분해되어 지방산으로 분해되거나 인산, 콜린, 당 등이 제거된 지질들이 생성된 때문으로 생각된다.
- 88)가 증가한 것으로 나타났다. 같은 조건으로 전개한 TLC 에 1%의 ninhydrin용액을 분무하였을 때 된장지질획분에서는 Rf=0.51과 0.49에서 보라색의 spot을 관찰할 수 있었으며 sphingosine 및 sphinganine의 Rf치와 비슷하였고 대두에서는 나타나지 않았다(Fig. 2B).
- IB는 1A와 같은 용매로 전개한 후 Dittmer 시약을 분무한 것으로 푸른색으로 발색된 인지질들을 보여준다. 대두 및비 지 의 지 질 획 분에서 는 표준물질 phosphatidyl ethanolamine (Rf=0.39) 및 phosphatydyl choline(Rf=0.33)의 높이와 비 슷한 곳에서 인지질들이 많이 나타났으나 된장에서는 많이 감소된 것으로 나타났다. 그러나 Fig.
- Table 1, 2 및 3과 같았다. 대두의 지 질 획 분은 아세톤상층액(AS 획분)과 아세톤침전물(AP 획분) 모두 1 mg/mL 농도에서 실험에 사용한 모든 암세포들에 대하여 세포 독성을 나타내지 않았으나 비지의 경우 0.5 mg/mL 농도에서 사람이나 mouse의 백혈암세포주에 독성을 나타내었으며 mouse sarcoma 세포에 대하여도 1 mg/mL 농도에서 독성을 나타내었다. 된장의 경우 AS 획분과 AP 획분 모두 대두 및 비지의 지질에 비하여 세포독성이 아주 강하였으며 0.
- 5 mg/mL 농도에서 사람이나 mouse의 백혈암세포주에 독성을 나타내었으며 mouse sarcoma 세포에 대하여도 1 mg/mL 농도에서 독성을 나타내었다. 된장의 경우 AS 획분과 AP 획분 모두 대두 및 비지의 지질에 비하여 세포독성이 아주 강하였으며 0.5 mg/mL 농도에서는 두 획분 모두 90% 이상 세포가 사멸하는 것을 볼 수 있었다. 된장지질의 AS 획분은 특히 0.
- 대두, 비지 및 된장의 총지질을 chk>roform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분을 얻었다. 된장지질의 AS 획분 및 AP 획분이 실험에 사용한 K562, Yacl 및 S180 암세포에 가장 강한 세포독성을 일으켰으며 비지의 AS 및 AP 획분 역시 된장보다는 약하지만 세포독성을 나타냈으나 대두의 지질획분들은 세포독성효과를 나타내지 않았다. 된장지질의 AS 및 AP 분획의 지질조성을 보면대두 및 비지에 비하여 많은 양의 유리지방산이 함유되어 있었다.
- 그러나 대두의 지질추출물에도비지의 지질추출물에서와 비슷한 양의 유리지 방산이 함유되어 있는 것으로 분석 결과 나타났으나 비지에 비하여 세포독성을 일으키지 않는 것으로 보아 유리지방산 이외의 지질성분들도 세포독성에 관여한다고 추정할 수 있匸+. 또한 본 실험에서 암세포에 대한 세포독성실험에서는 대두지질의 효과가 나타나지 않았으나 콩이나 비지를 음식물로 섭취하면 췌장의 lipase 및 장내 미 생물들에 의하여 콩이나 비지의 지질이 가수분해되어 유리지방산이 생성될 것이므로 생 체에서는 된장보다는 약하지만 세포 독성을 나타낼 것으로 예견할 수 있다.
- 된장지질의 AS 및 AP 분획의 지질조성을 보면대두 및 비지에 비하여 많은 양의 유리지방산이 함유되어 있었다. 또한 지질획분들을 0.4 N KOH/methan이로 약알카리분해하고 silica gel TLC로 분석한 결과, 된장의 지 질획분에서는 대두 및 비지에서 보이지 않았던 알카리에 안정하고 ninhydrin에 양성인 물질들이 여러개 나타났으며 이들은 유리 sphingoid base 및 psycosin으로 추정되었다.
- 1과 같았다. 본 실험에서는 총지질을 중성지질, 당지질 및 인지질로 분리하지 않은 혼합지질상태에서 복합지질 전개용매를 사용하여 TLC를 행 하였으므로 농도%를 정확하게 계산할 수 없었으나 여러 종류의 발색 시약을 분무하여 지 질의 조성을 비교할 수 있었다. Fig.
- 추정할 수 있다. 본 연구에서는 여러 종류의 백혈암 세포에 대한 in vitro 실험에서 콩의 지 질획분은 1 mg/ml 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났으나(Table 1, 2, 3), Sc- hmelz 등의 mouse를 이용한 in vivo 실험에서는 대두의 glu- cosylceramide가 우유의 sphingomy이in보다 대장암의 악성화를 저해하는 효과가 높다고 하였는데 이는 소장 및 대장 내에서 일어나는 췌장의 소화효소 및 미생물의 분해효소에 의한 sphingolipid의 가수분해 결과라고 볼 수 있다. 우유 및 버터 등 동물성 식 품의 sphingolipid는 주로 sphingomyelin 으로 존재하는 반면 대두는 glycosylceramidee.
- 이와 같이 된장이 대두 및 비지와는 달리 phosphatidyl ethanolamine 또는 sulfphoglycosylceramide 등의 물질이 감소된 것은 오랜 기 간 발효숙성 되는 과정에서 자가효소 및 미 생물에 의하여 발효되는 과정에서 복합지질들이 가수분해되어 지방산으로 분해되거나 인산, 콜린, 당 등이 제거된 지질들이 생성된 때문으로 생각된다. 위의 결과에서 된장지질의 AP 분획 및 AS분획에 대두나 비지보다 유리지 방산이 많이 함유되어 있어 일부 세포독성효과를 나타낸 것으로 추정할 수 있다. 그러나 대두의 지질추출물에도비지의 지질추출물에서와 비슷한 양의 유리지 방산이 함유되어 있는 것으로 분석 결과 나타났으나 비지에 비하여 세포독성을 일으키지 않는 것으로 보아 유리지방산 이외의 지질성분들도 세포독성에 관여한다고 추정할 수 있匸+.
- 가수분해하였다. 즉, Folch 법으로 정제하고 acetone으로 분리 한 분획들(AP분획 및 AS 분획 )을 0.4 N KOH/methanol로 비누화하여 glycerol 함유 지질을 가수분해한 다음 alkali성 증류수로 세 척하여 약 alkali에 안정 한 지 질을 얻었다. 각지 질분 획들의 지방산조성을 측정하기 위하여 지질분 획을 speed vac으로 건조한 다음 5%의 무수 methanol성 HC1 로 80 ℃에서 18시간동안 가수분해하였다.
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