대두식품들로부터 추출한 지질분획들이 사람의 K562 백혈구암세포, mouse의 Yak1 백혈구암세포 및 S180 고형암세포에 미치는 세포독성 효과를 MTT assay법으로 조사하였다. 대두, 비지 및 된장의 총지질을 chloroform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분)을 얻었다 된장지질의 AS 획분 및 AP 획분이 실험에 사용한 K562, Yac1 및 S180암세포에 가장 강한 세포독성을 일으켰으며 비지 의 AS 및 AP 획분 역시 된장보다는 약하지만 세포독성을 나타냈으나 대두의 지질획분들은 세포독성효과를 나타내지 않았다. 된장지질의 AS 및 AP분획의 지질조성을 보면 대두 및 비지에 비하여 많은 양의 유리지방산이 함유되어 있었다. 또한 지질획 분들을 0.4 N KOH/methanol로 약알카리 분해하고 silica gel TLC로 분석한 결과, 된장의 지질획분에서는 대두 및 비지에서 보이지 않았던 알카리에 안정하고 ninhydrin에 양성인 물질들이 여러개 나타났으며 이들은 유리 sphingoid base 및 psycusin으로 추정되었다.
대두식품들로부터 추출한 지질분획들이 사람의 K562 백혈구암세포, mouse의 Yak1 백혈구암세포 및 S180 고형암세포에 미치는 세포독성 효과를 MTT assay법으로 조사하였다. 대두, 비지 및 된장의 총지질을 chloroform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분)을 얻었다 된장지질의 AS 획분 및 AP 획분이 실험에 사용한 K562, Yac1 및 S180암세포에 가장 강한 세포독성을 일으켰으며 비지 의 AS 및 AP 획분 역시 된장보다는 약하지만 세포독성을 나타냈으나 대두의 지질획분들은 세포독성효과를 나타내지 않았다. 된장지질의 AS 및 AP분획의 지질조성을 보면 대두 및 비지에 비하여 많은 양의 유리지방산이 함유되어 있었다. 또한 지질획 분들을 0.4 N KOH/methanol로 약알카리 분해하고 silica gel TLC로 분석한 결과, 된장의 지질획분에서는 대두 및 비지에서 보이지 않았던 알카리에 안정하고 ninhydrin에 양성인 물질들이 여러개 나타났으며 이들은 유리 sphingoid base 및 psycusin으로 추정되었다.
The cytotoxic effects of lipid extracts from soybean products were studied using K562 human leukemia cell, Yac1 mouse leukemia cell and S 180 mouse sarcoma cell. Total lipids from soybean powder, soybean curd residue and doenjang were extracted with chloroform/methanol (2 : 1) and water saturated bu...
The cytotoxic effects of lipid extracts from soybean products were studied using K562 human leukemia cell, Yac1 mouse leukemia cell and S 180 mouse sarcoma cell. Total lipids from soybean powder, soybean curd residue and doenjang were extracted with chloroform/methanol (2 : 1) and water saturated butanol, consecutively, and fractionated into acetone supernatants (AS fraction) and acetone precipitates (AP fraction) by adding excess acetone. AS fraction of doenjang lipids showed the strongest cytotoxic effects on K562, Yac1 and S180 cancer cells, whereas each lipid fraction of soybean curd residue also showed relatively weak cytotoxic effects on cancer cells but soybean powder did not. AS and AP fractions of doenjang contained more free fatty acids than those of soybean curd residue and soybean. And when lipid fractions were digested with 0.4 N KOH/methanol, doenjang lipid fractions showed to contain some alkali-stable substances which showed positive reaction with ninhydrin solution on silica TLC separation.
The cytotoxic effects of lipid extracts from soybean products were studied using K562 human leukemia cell, Yac1 mouse leukemia cell and S 180 mouse sarcoma cell. Total lipids from soybean powder, soybean curd residue and doenjang were extracted with chloroform/methanol (2 : 1) and water saturated butanol, consecutively, and fractionated into acetone supernatants (AS fraction) and acetone precipitates (AP fraction) by adding excess acetone. AS fraction of doenjang lipids showed the strongest cytotoxic effects on K562, Yac1 and S180 cancer cells, whereas each lipid fraction of soybean curd residue also showed relatively weak cytotoxic effects on cancer cells but soybean powder did not. AS and AP fractions of doenjang contained more free fatty acids than those of soybean curd residue and soybean. And when lipid fractions were digested with 0.4 N KOH/methanol, doenjang lipid fractions showed to contain some alkali-stable substances which showed positive reaction with ninhydrin solution on silica TLC separation.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 대두와 두부제조 부산물인 비지 및 한국의 전통발효식품인 된장의 지질획분의 생리 활성기 능을 시험 하기 위하여 우선 지 질 을 추출한 다음 acetone으로 부분분획 하고 여러 종류의 암세포들에 대한 세 포독성 시 험을 하였으며 silicic acid column chromatography, silica gel TLC 및 densitometer 등을 이용하여 지 질획 분의 조성 을 비교하고 sphingolipid에 대한 연구를 위한 기초실험을 하였다.
Sullards 등(24)은 대두의 glycosylceramide-i* 대 장균의 glucoceramidasee- 처리 하여 얻은 ceramidee]- 우유의 sphingomy이in으로부터 얻은 cer- amide보다 대장암세포인 HT29 cell의 apoptosis를 일으키는데 더 효과가 있었다고 하였다. 본 연구에서 된장의 발효 과정에서 대두에 함유되어 있는 glycosylceramide는 분해되어 함량이 감소하였지 만 그 대신 생성된 ceramide 또는 sphingosine, sphinganine, phytosphingosine 등이 세포에 직접적 인 생리활성을 가지기 때문에 대두 및 비지보다도, 7? 贝"。실험에서 암세포에 세포독성을 나타낼 수도 있었던 것으로 생각되며 대두 및 대두발효식품의 sphingolipid 조성 및 항암효과에 대한 연구를 진행하고 있다.
제안 방법
Lipase, protease 등을 불활성 화시 킨 대 두, 비지 및 된장으로부터 추출한 지질에 과량의 아세톤을 가하여 침전된 분획(AP 분획)과 비 침 전분획 (AS 분획)을 농축 건조하고 용매 및 배양액을 이용하여 1 mg/mL 농도로 조제한 다음 96 well micropiate에서 단계별 회석하고 사람의 백혈암 세포주인 K562 세포, mouse의 백혈암 세포주인 Yacl 세포 및 mouse의 고형암 세포주인 sarcoma 180 세포에 대한 세포독성을 관찰한 결과는 Table 1, 2 및 3과 같았다. 대두의 지 질 획 분은 아세톤상층액(AS 획분)과 아세톤침전물(AP 획분) 모두 1 mg/mL 농도에서 실험에 사용한 모든 암세포들에 대하여 세포 독성을 나타내지 않았으나 비지의 경우 0.
항암효과가 있다고 하였다. Sphingolipid는 약알칼리에 가수분해되지 않으므로 약알칼리에 안정한 lipid를 분리하여 sphingolipid의 존재를 일부 하인하였다. 각 분획을 0.
각 지 질시료에 다량 존재하는 glycerolipid를 가수분해하고 N-acyl lipid인 sphingolipid를 얻기 위하여 약염 기 용액으로 가수분해하였다. 즉, Folch 법으로 정제하고 acetone으로 분리 한 분획들(AP분획 및 AS 분획 )을 0.
총지질의 일부는 silicic acid column chromatography 방법으로 분획하였으며 각 분획들을 지질표준품과 함께 TLC로 전개하였고 발색시약들을 분무하여 지질을 확인하였다. 당지질을 검출하기 위하여는 orcinol-ferHc chloride-황산 시약 및 a -naphtol 시약을, 아미노지질은 1% ninhydrin/acetone 시 약을, 아미 드지 질은 차아염소산-benzidin 시 약을, 인지질은 molybden trioxide 및 molybden0] 함유된 Dittmer 시약을, sterol 지질 및 일반지질은50% 황산을 분무하여 100~ 120℃에서 가열한 다음 지질성분들을 확인하였다(21).
세포독성시험을 위하여 배양한 세포들을 phosphate buffered saline(PBS)로 세 척 한 다음 trypan blue액에 현탁하여 세포수를 센 다음 배양액으로 희석하였다. 대두 및 대두발효식품의 총지질을 아세톤으로 분획한 아세톤 침 전물(AP 분획 ) 및 아세톤상층액 (AS 분획 을 농축하여 용매를 제거한 후 소량의 chloroform 및 methanol을 이용하여 녹이고 DMEM 배양액으로 희석 하여 1 mg/mL 농도로 시료를 조제하였다. 96 well microplate에서 1 mg/mL 농도의 시 료를 단계 적 2배 희 석 법 으로 희 석 하고 시 료가 있는 microplate well 당 암세포를 4000 cell 되 게 넣은 다음 72시간 동안 배양하였다.
대두, 비지 및 된장의 지질을 아세톤으로 분획한 AP 분획과 AS분획의 지질조성을 비교하기 위하여 각 지질분획을 silica gel TLC plate 위에서 여러 혼합용매계로 분리하고 발색시약을 분무한 다음 105℃에서 건조하여 비교하였다. 단순지질 분리용 전개용매로 AS 및 AP 지질분획을 전개한 경우 Table4에서와 같이 된장지질에는 대두 또는 비지에 비하여 triglyceride는 22.
대두, 비지 및 된장의 총지질을 chk>roform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분을 얻었다. 된장지질의 AS 획분 및 AP 획분이 실험에 사용한 K562, Yacl 및 S180 암세포에 가장 강한 세포독성을 일으켰으며 비지의 AS 및 AP 획분 역시 된장보다는 약하지만 세포독성을 나타냈으나 대두의 지질획분들은 세포독성효과를 나타내지 않았다.
대두는 농협 에서 구입한 국산 대두콩 2 kg을 잘 닦은 다음 분쇄기로 갈아 가루를 만들었으며 비지는 부산시에 소재하는 동아식품에서 두부제조시 부산물인 생비지를 얻어 동결 건조하였고, 된장은 국산 대두콩으로 제조한 메주로 담아 1년간 숙성 시 킨 시료를 동결 건조한 후 분말화하였다. 모든 시 료들은 지질을 추출하기 전 autoclave에서 15분간 멸균하여 lipase 또는 protease 등의 효소를 불활성 화 시 킨 다음 실험 에 사용하였다.
대두식품들로부터 추출한 지 질분획들이 사람의 K562 백혈구암세 포, mouse의 Yakl 백 혈구암세포 및 S180 고형 암세포에 미치는 세포독성 효과를 MTT assay법으로 조사하였다. 대두, 비지 및 된장의 총지질을 chk>roform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분을 얻었다.
96 well microplate에서 1 mg/mL 농도의 시 료를 단계 적 2배 희 석 법 으로 희 석 하고 시 료가 있는 microplate well 당 암세포를 4000 cell 되 게 넣은 다음 72시간 동안 배양하였다. 세포독성을 관찰하기 위하여 PBS에 5mg/m丄되게 녹인 MTT[3-(4, 5 dimethyIthizol- 2-y 1) 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide] 용액 20 uL씩 을 첨 가하고 匸}시 4시 간 동안 37℃에서 배양한 후 각 well당 10% SDS용액을 가하고 빛을 차광한 상태에서 하룻밤 실온에서 방치한 다음 흡광도는 microplate reader (model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정 하였다(19).
암세포에 대한 세포독성시험을 위하여 acetone 침전법으로 조단순지 질 및 조복합지 질로 분획 하였다. 즉, Folch 법으로 정제된 지질을 농축하여 소량의 chloroform : methanol(2 : 1)에 녹인 다음 20배 용량의 acetone을 가한 후 4℃에서 16시간 동안 놓아두어 그 침전물을 여과하고 농축하여 용매를 제거 흐t 다음 아세톤 비 가용분획 (AP : acetone precipitates) 및 아세톤 가용분획 (AS : acetone supernatants)으로 나누어 실험에 사용하였다.
조단순지 질 및 조복합지 질로 분획 하였다. 즉, Folch 법으로 정제된 지질을 농축하여 소량의 chloroform : methanol(2 : 1)에 녹인 다음 20배 용량의 acetone을 가한 후 4℃에서 16시간 동안 놓아두어 그 침전물을 여과하고 농축하여 용매를 제거 흐t 다음 아세톤 비 가용분획 (AP : acetone precipitates) 및 아세톤 가용분획 (AS : acetone supernatants)으로 나누어 실험에 사용하였다.
농축된 지질로부터 오염된 비지질획분을 제거하기 위하여 Folch법(20)으로 정제하였다. 총지질의 일부는 silicic acid column chromatography 방법으로 분획하였으며 각 분획들을 지질표준품과 함께 TLC로 전개하였고 발색시약들을 분무하여 지질을 확인하였다. 당지질을 검출하기 위하여는 orcinol-ferHc chloride-황산 시약 및 a -naphtol 시약을, 아미노지질은 1% ninhydrin/acetone 시 약을, 아미 드지 질은 차아염소산-benzidin 시 약을, 인지질은 molybden trioxide 및 molybden0] 함유된 Dittmer 시약을, sterol 지질 및 일반지질은50% 황산을 분무하여 100~ 120℃에서 가열한 다음 지질성분들을 확인하였다(21).
대상 데이터
3종류의 암세포, 즉 사람의 K562 leukemia cell, mouse의 Yacl leukemia cell 및 Sarcoma 180 cell을 10% fetal bovine serum 및 streptomycin, penicillin 등이 함유된 RPMI 1640 media에서 배양하였다. 세포독성시험을 위하여 배양한 세포들을 phosphate buffered saline(PBS)로 세 척 한 다음 trypan blue액에 현탁하여 세포수를 센 다음 배양액으로 희석하였다.
030. Experiments were performed in triplicate.
이론/모형
다음 여과액들을 합하여 농축하였다. 농축된 지질로부터 오염된 비지질획분을 제거하기 위하여 Folch법(20)으로 정제하였다. 총지질의 일부는 silicic acid column chromatography 방법으로 분획하였으며 각 분획들을 지질표준품과 함께 TLC로 전개하였고 발색시약들을 분무하여 지질을 확인하였다.
성능/효과
2A에서 나타난 바와 같이 fr. 1(chloroform : methanol=90 :10)의 경우 5% 황산용액의 분무시 대두에서 monoglycosylceramide의 Rf치와 비슷한 Rf=0.74에서 진한 spot을 볼 수 있었으나 된장에서 는 glycosylceramide는 감소한 반면 ceramide(Rf= 0.88)가 증가한 것으로 나타났다. 같은 조건으로 전개한 TLC 에 1%의 ninhydrin용액을 분무하였을 때 된장지질획분에서는 Rf=0.
본 실험에서는 총지질을 중성지질, 당지질 및 인지질로 분리하지 않은 혼합지질상태에서 복합지질 전개용매를 사용하여 TLC를 행 하였으므로 농도%를 정확하게 계산할 수 없었으나 여러 종류의 발색 시약을 분무하여 지 질의 조성을 비교할 수 있었다. Fig. 1A에서와 같이 痘 -naphtol-황산용액에 의하여 보라색으로 발색된 당지질을 비교해보면 대두 및 비지에서는 acylsterylglycoside(Rf=0.75), sterylglycoside(Rf= 0.55), glycosylceramide(Rf=0.53, 0.48), sulfoglycosyl ceramide (sulfatides, Rf=0.30), unknown glycolipid(Rf=0.16) 등이 발견되었으나 된장의 경우 acylsterylglycoside 및 sterylgly- coside는 사라지지 않았고 glycosylceramide는 많이 감소하였으며 낮은 위치의 당지질 spot들은 거의 보이지 않았다. Front line 및 그 위쪽에 나타난 커다란 반점은 혼합용매로 올리기 전에 미리 ether로 끝까지 전개하여 나타난 중성지질들이다.
18)을 발견할 수 있었다. Fig. ID는 amide 또는 2급아민을 가진 지 질을 나타내는 녹색바탕에 노란 반점으로 대두와 비지의 AP 획분에서는 phosphatidylethanolamine(Rf=0.39), sulfphoglycosylcer- amide(Rf=3.0) 및 Rf=0.16인 미지의 물질이 풍부하였으나 된장의 경우 AP 및 AS획분에서는 많이 감소한 것으로 나타났다. 이와 같이 된장이 대두 및 비지와는 달리 phosphatidyl ethanolamine 또는 sulfphoglycosylceramide 등의 물질이 감소된 것은 오랜 기 간 발효숙성 되는 과정에서 자가효소 및 미 생물에 의하여 발효되는 과정에서 복합지질들이 가수분해되어 지방산으로 분해되거나 인산, 콜린, 당 등이 제거된 지질들이 생성된 때문으로 생각된다.
88)가 증가한 것으로 나타났다. 같은 조건으로 전개한 TLC 에 1%의 ninhydrin용액을 분무하였을 때 된장지질획분에서는 Rf=0.51과 0.49에서 보라색의 spot을 관찰할 수 있었으며 sphingosine 및 sphinganine의 Rf치와 비슷하였고 대두에서는 나타나지 않았다(Fig. 2B).
IB는 1A와 같은 용매로 전개한 후 Dittmer 시약을 분무한 것으로 푸른색으로 발색된 인지질들을 보여준다. 대두 및비 지 의 지 질 획 분에서 는 표준물질 phosphatidyl ethanolamine (Rf=0.39) 및 phosphatydyl choline(Rf=0.33)의 높이와 비 슷한 곳에서 인지질들이 많이 나타났으나 된장에서는 많이 감소된 것으로 나타났다. 그러나 Fig.
Table 1, 2 및 3과 같았다. 대두의 지 질 획 분은 아세톤상층액(AS 획분)과 아세톤침전물(AP 획분) 모두 1 mg/mL 농도에서 실험에 사용한 모든 암세포들에 대하여 세포 독성을 나타내지 않았으나 비지의 경우 0.5 mg/mL 농도에서 사람이나 mouse의 백혈암세포주에 독성을 나타내었으며 mouse sarcoma 세포에 대하여도 1 mg/mL 농도에서 독성을 나타내었다. 된장의 경우 AS 획분과 AP 획분 모두 대두 및 비지의 지질에 비하여 세포독성이 아주 강하였으며 0.
5 mg/mL 농도에서 사람이나 mouse의 백혈암세포주에 독성을 나타내었으며 mouse sarcoma 세포에 대하여도 1 mg/mL 농도에서 독성을 나타내었다. 된장의 경우 AS 획분과 AP 획분 모두 대두 및 비지의 지질에 비하여 세포독성이 아주 강하였으며 0.5 mg/mL 농도에서는 두 획분 모두 90% 이상 세포가 사멸하는 것을 볼 수 있었다. 된장지질의 AS 획분은 특히 0.
대두, 비지 및 된장의 총지질을 chk>roform/methanol(2 : 1) 및 물포화 butanol로 추출하고 20배 용량의 acetone을 가하여 아세톤상층액(AS 획분) 및 아세톤침전물(AP 획분을 얻었다. 된장지질의 AS 획분 및 AP 획분이 실험에 사용한 K562, Yacl 및 S180 암세포에 가장 강한 세포독성을 일으켰으며 비지의 AS 및 AP 획분 역시 된장보다는 약하지만 세포독성을 나타냈으나 대두의 지질획분들은 세포독성효과를 나타내지 않았다. 된장지질의 AS 및 AP 분획의 지질조성을 보면대두 및 비지에 비하여 많은 양의 유리지방산이 함유되어 있었다.
그러나 대두의 지질추출물에도비지의 지질추출물에서와 비슷한 양의 유리지 방산이 함유되어 있는 것으로 분석 결과 나타났으나 비지에 비하여 세포독성을 일으키지 않는 것으로 보아 유리지방산 이외의 지질성분들도 세포독성에 관여한다고 추정할 수 있匸+. 또한 본 실험에서 암세포에 대한 세포독성실험에서는 대두지질의 효과가 나타나지 않았으나 콩이나 비지를 음식물로 섭취하면 췌장의 lipase 및 장내 미 생물들에 의하여 콩이나 비지의 지질이 가수분해되어 유리지방산이 생성될 것이므로 생 체에서는 된장보다는 약하지만 세포 독성을 나타낼 것으로 예견할 수 있다.
된장지질의 AS 및 AP 분획의 지질조성을 보면대두 및 비지에 비하여 많은 양의 유리지방산이 함유되어 있었다. 또한 지질획분들을 0.4 N KOH/methan이로 약알카리분해하고 silica gel TLC로 분석한 결과, 된장의 지 질획분에서는 대두 및 비지에서 보이지 않았던 알카리에 안정하고 ninhydrin에 양성인 물질들이 여러개 나타났으며 이들은 유리 sphingoid base 및 psycosin으로 추정되었다.
1과 같았다. 본 실험에서는 총지질을 중성지질, 당지질 및 인지질로 분리하지 않은 혼합지질상태에서 복합지질 전개용매를 사용하여 TLC를 행 하였으므로 농도%를 정확하게 계산할 수 없었으나 여러 종류의 발색 시약을 분무하여 지 질의 조성을 비교할 수 있었다. Fig.
추정할 수 있다. 본 연구에서는 여러 종류의 백혈암 세포에 대한 in vitro 실험에서 콩의 지 질획분은 1 mg/ml 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났으나(Table 1, 2, 3), Sc- hmelz 등의 mouse를 이용한 in vivo 실험에서는 대두의 glu- cosylceramide가 우유의 sphingomy이in보다 대장암의 악성화를 저해하는 효과가 높다고 하였는데 이는 소장 및 대장 내에서 일어나는 췌장의 소화효소 및 미생물의 분해효소에 의한 sphingolipid의 가수분해 결과라고 볼 수 있다. 우유 및 버터 등 동물성 식 품의 sphingolipid는 주로 sphingomyelin 으로 존재하는 반면 대두는 glycosylceramidee.
이와 같이 된장이 대두 및 비지와는 달리 phosphatidyl ethanolamine 또는 sulfphoglycosylceramide 등의 물질이 감소된 것은 오랜 기 간 발효숙성 되는 과정에서 자가효소 및 미 생물에 의하여 발효되는 과정에서 복합지질들이 가수분해되어 지방산으로 분해되거나 인산, 콜린, 당 등이 제거된 지질들이 생성된 때문으로 생각된다. 위의 결과에서 된장지질의 AP 분획 및 AS분획에 대두나 비지보다 유리지 방산이 많이 함유되어 있어 일부 세포독성효과를 나타낸 것으로 추정할 수 있다. 그러나 대두의 지질추출물에도비지의 지질추출물에서와 비슷한 양의 유리지 방산이 함유되어 있는 것으로 분석 결과 나타났으나 비지에 비하여 세포독성을 일으키지 않는 것으로 보아 유리지방산 이외의 지질성분들도 세포독성에 관여한다고 추정할 수 있匸+.
가수분해하였다. 즉, Folch 법으로 정제하고 acetone으로 분리 한 분획들(AP분획 및 AS 분획 )을 0.4 N KOH/methanol로 비누화하여 glycerol 함유 지질을 가수분해한 다음 alkali성 증류수로 세 척하여 약 alkali에 안정 한 지 질을 얻었다. 각지 질분 획들의 지방산조성을 측정하기 위하여 지질분 획을 speed vac으로 건조한 다음 5%의 무수 methanol성 HC1 로 80 ℃에서 18시간동안 가수분해하였다.
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