순천만 갯벌의 세균 군집의 다양성을 조사하기 위해 16S rDNA의 다양성을 조사하였다. 갯벌로부터 전체 핵산을 분리한 후, 세균에 상보적인 universal primer로 증폭된 16S rDNA로부터 클론 라이브러리를 만들었다. 총 111개의 클론으로부터 HaeIII를 이용하여 amplified rDNA restriction analysis (ARDRA)를 수행하고, Gelcompar II 프로그램을 이용하여 pattern을 clustering하였다. 111개의 클론 중 100가지의 서로 다른 RFLP type이 조사되었고, 이들 중 전체 클론 라이브러리를 대표할 수 있는 20개의 클론을 선별하여 부분적인 염기서열을 분석하여 세균 다양성을 분석하였다. 20개의 클론중에는 RDP와 GenBank에서 제공하는 small subunit RNA database와 동일한 클론은 존재하지 않았으며, 이미 알려진 배양 가능한 세균의 16S rRNA 염기서열과 비교 하였을때 77∼96.8%의 유사도를 보였다. 또한 이들 20개의 클론은 alpha-, delta-, gamma-Proteobacteria, low G+C Gram positive bacteria, high G+C Gram positive bacteria, Sphingobacteria (Cytophaga); Cyanobacteria (Chloroplast)등 주요한 7개 lineage에 속했으며, 클론들 중 Proteobacteria가 우점종을 차지하고 있었다.
순천만 갯벌의 세균 군집의 다양성을 조사하기 위해 16S rDNA의 다양성을 조사하였다. 갯벌로부터 전체 핵산을 분리한 후, 세균에 상보적인 universal primer로 증폭된 16S rDNA로부터 클론 라이브러리를 만들었다. 총 111개의 클론으로부터 HaeIII를 이용하여 amplified rDNA restriction analysis (ARDRA)를 수행하고, Gelcompar II 프로그램을 이용하여 pattern을 clustering하였다. 111개의 클론 중 100가지의 서로 다른 RFLP type이 조사되었고, 이들 중 전체 클론 라이브러리를 대표할 수 있는 20개의 클론을 선별하여 부분적인 염기서열을 분석하여 세균 다양성을 분석하였다. 20개의 클론중에는 RDP와 GenBank에서 제공하는 small subunit RNA database와 동일한 클론은 존재하지 않았으며, 이미 알려진 배양 가능한 세균의 16S rRNA 염기서열과 비교 하였을때 77∼96.8%의 유사도를 보였다. 또한 이들 20개의 클론은 alpha-, delta-, gamma-Proteobacteria, low G+C Gram positive bacteria, high G+C Gram positive bacteria, Sphingobacteria (Cytophaga); Cyanobacteria (Chloroplast)등 주요한 7개 lineage에 속했으며, 클론들 중 Proteobacteria가 우점종을 차지하고 있었다.
In order to investigate the diversity of bacterial community in the mud flat of Sunchon Bay, Chunnam province, diversity of amplified 16S rDNA was examined. Total DNA was extracted from sediment soils and 16S rDNAs were amplified using PCR primers based on the universally conserved sequences in bact...
In order to investigate the diversity of bacterial community in the mud flat of Sunchon Bay, Chunnam province, diversity of amplified 16S rDNA was examined. Total DNA was extracted from sediment soils and 16S rDNAs were amplified using PCR primers based on the universally conserved sequences in bacteria. Clonal libraries were constructed and 111 clones were examined by amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) using HaeIII. Clones were clustered based on restriction patterns using computer program, GelCompar II. One hundred different RFLP types were detected from 111 clones. The 20 clones were selected and sequenced according to dendrograms derived from ARDRA, to cover most of the bacterial diversity in the clone libraries. None of the clones were identical to any representatives in the Ribosomal Database Project small subunit RNA databases and GenBank. All sequences showed between 77 and 96.8% similarity to the known 16s rRNA sequence from cultured organisms. The 20 clones sequenced fell into seven major lineages of the domain Bacteria: alpha-, delta-, gamma-Proteobacteria, low G+C Gram positive bacteria, high G+C Gram positive bacteria, Sphingobacteria (Cytophaga) and Cyanobacteria (chloroplast). Among the clones, the Proteobacteria were dominant.
In order to investigate the diversity of bacterial community in the mud flat of Sunchon Bay, Chunnam province, diversity of amplified 16S rDNA was examined. Total DNA was extracted from sediment soils and 16S rDNAs were amplified using PCR primers based on the universally conserved sequences in bacteria. Clonal libraries were constructed and 111 clones were examined by amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) using HaeIII. Clones were clustered based on restriction patterns using computer program, GelCompar II. One hundred different RFLP types were detected from 111 clones. The 20 clones were selected and sequenced according to dendrograms derived from ARDRA, to cover most of the bacterial diversity in the clone libraries. None of the clones were identical to any representatives in the Ribosomal Database Project small subunit RNA databases and GenBank. All sequences showed between 77 and 96.8% similarity to the known 16s rRNA sequence from cultured organisms. The 20 clones sequenced fell into seven major lineages of the domain Bacteria: alpha-, delta-, gamma-Proteobacteria, low G+C Gram positive bacteria, high G+C Gram positive bacteria, Sphingobacteria (Cytophaga) and Cyanobacteria (chloroplast). Among the clones, the Proteobacteria were dominant.
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제안 방법
100 ㎕의 8M potassium acetate를 넣고, 실온에서 15분 동안 방치 한 후 원심분리(1Q000X& 15 min, 실온)하여 상층액을 모았다. 0.6 volume의 iso-propanol로 침전시키고, 70% etha- nol로 세척하여 건조시킨 후 500 ㎕의 멸균수에 녹여 0.75% Seaplaque GTG agarose (FMC BioProducts, Rockland, Maine) g이에 전기영동(5 V/cm)하여 23 kb에 위치하는 chromosomal DNA를 PCR반응의 주형으로 이용하기 위해 gel을 절단한 후 agarase (Boehringer GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 2차 정제를 수행하였다.
5 V/cm로 전기영동 하였다. 50~100 bp ladder (BMA, Rockland, Maine) 를 DNA marker 로 사용하였고, multi-lane screener program (GelCompar II; Applied Maths, Belgium)을 이용하여 DNA fragment pattern을 clustering하였다. 클론의 RFLP 분석에 의해서 얻어진 genetic diversity 를 추정하기 위해 coverage value (C)를 계산하였다(19).
ARDRA의 결과로부터 유사도 값이 50% 이상에서 구분되는 monophyletic group을 중심으로 9개의 cluster로 나누었고, 각 cluster에서 최소한 1개 이상의 클론을 선별하였으며, ARDRA의 유사도와 16S rDNA 염기서 열간의 상관관계를 조사하기 위하여 유사도 값에 따라서 클론을 선별하여 총 20개의 클론에 대하여 염기서열을 분석하였다. rDNA 유전자서열을 분석하기 위해 prGTf, prGTr로 증폭된 PCR산물을 DNA PrepMate™ (BIONEER, Cheongwon.
Eubacterial I6S rDNA를 증폭시키기 위하여 8F와 1492R primei를 사용하여 약 1.5 kb에 해당하는 PCR 반응산물을 확인하였고, PCR 산물을 pGEM-T Easy Vector에 삽입하여 총 111개의 클론을 얻었다. 각 클론들의 ARDRA pattern을 UP0MA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic means) 방법에 의해 분석한 결과 50% 정도의 RFLP 유사도에 따라 9개의 cluster로 나뉘어졌으며, 100개의 서로 다른 RFLP type으로 조사되었고(Fig.
0)로 충분히 분산시키고, 375 mg lysozyme을 넣고 균질화시킨 후 37℃ 수조에서 15분 간격으로 vortex를 이용하여 섞어주면서 1시간 동안 반응시켰다. Lysozyme을 처리한 시료를 얼음 속에 담가 10분 동안 냉각시키고 12 ml의 20% SDS를 첨가하여 실온에 20분 동안 방치한 후 액체질소와 65UC 수조에서 각 10분씩 번갈아 넣어 주어 얼림과 녹임을 3회 반복하였다. Phenol과 chloroform/iso- amylalcohol (24:1)으로 핵산을 추출한 후 ethanol로 침전시켜 crude DNA를 회수하였다.
Lysozyme을 처리한 시료를 얼음 속에 담가 10분 동안 냉각시키고 12 ml의 20% SDS를 첨가하여 실온에 20분 동안 방치한 후 액체질소와 65UC 수조에서 각 10분씩 번갈아 넣어 주어 얼림과 녹임을 3회 반복하였다. Phenol과 chloroform/iso- amylalcohol (24:1)으로 핵산을 추출한 후 ethanol로 침전시켜 crude DNA를 회수하였다. Total DNA의 정제를 위해 2 ml의 crude DNA에 2 g의 CsCl를 첨가한 후 실온에서 1-3시간동안 방치하고 IQOOOXg로 20분간 원심분리한 후 상층액을 새 튜브 에 옮겼다.
CA)에 의해 수행하였으며, 유전자 서열 분석을 위해 8F primer 를 사용하였다. RDP (Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK_CHIMERA 프로그램에 의해 chimem artifaci를 확인하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST search program 과 RDP를 이용하여 DNA database와 유사한 sequence를 비교하였다(29). 여기에서 얻어진 염기서열과 클론들의 염기서열은 Phydit program(7)Tr 사용하여 2차 구조에 바탕을 두고 정렬하였으며, 분석된 클론의 염기서열 길이가 다를 경우 가장 짧은 것을 기준으로 하였고.
ARDRA의 결과로부터 유사도 값이 50% 이상에서 구분되는 monophyletic group을 중심으로 9개의 cluster로 나누었고, 각 cluster에서 최소한 1개 이상의 클론을 선별하였으며, ARDRA의 유사도와 16S rDNA 염기서 열간의 상관관계를 조사하기 위하여 유사도 값에 따라서 클론을 선별하여 총 20개의 클론에 대하여 염기서열을 분석하였다. rDNA 유전자서열을 분석하기 위해 prGTf, prGTr로 증폭된 PCR산물을 DNA PrepMate™ (BIONEER, Cheongwon. Korea)로 정제하였다. 유전자 서열분석은 Big-Dye Cycle Sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City.
각각의 형질 전환된 클론들은 5'-TAC GAC TCA CTA TAG GGC GA-3' (prGTf)를 forward primer로 5-ACT CAA GCT ATG CAT CCA AC-3' (prGTr)를 reverse primer (8)로 사용하여 direct reamplified PCR을 수행하여 약 1.5 kb의 PCR 산물을 얻었다. PCR 반응조건은 반응부피를 50 ㎕로 하여 94℃에서 5분 간 pre-denature 시킨 후, 총 25 cycles (denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 60℃ for 1 min, extension at 72℃ for 2 min)로 반응시킨 후 72, C에서 10분간 더 반응시켰다.
따라서 자연상태에 존재하는 미생물의 정확한 분석을 위해서는 클로닝과 염기서열의 분석, 또는 hybridizing probing 방법을 사용하기 위해 자연 상태의 시료로부터 편중되지 않은 핵산의 추출과 회수가 필수적이다. 본 연구에서는 갯벌로부터 전체 핵산을 추출하기 위하여 Elsas와 Smalla (1995)의 방법을 변형하여 이용하였다. Ethanol 침전시에는 갯벌자체에 염농도가 매우 높으므로 NaCI을 넣지 않 았으며.
본 연구에서는 전남 순친만의 갯벌토양으로부터 직접 DNA를 주줄하고 eubacteria의 16S rDNA 승폭용 universal primer를 사용하여 I6S rDNA 클론 라이브리리를 제작하여 amplified rDNA restriction analysis (ARDRA)를 수행하였고. 이들 중 일부를 선별하여 16S rDNA partial sequence늘 분석하여 DNA database와 함께 비교하고 계통분석을 통하여 순천만 갯벌의 미생물구집의 다양성을 조사하였다.
분리한 total DNA에서 eubacterial 16S rDNA를 증폭시키기 위하여 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG' (8F: positions 8 to 27nt, E. coli 16S rDNA numbering)을 forward primer로 5'- GGT TAC CTT GTT ACG ACTT' (1492R: positions 1510 to 1492nt, E. coll 16S rDNA numbering)를 reverse primer로 사용하여 PCR을 수행하였다(12). PCR 조건은 200 ng의 template DNA와 0.
RDP (Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK_CHIMERA 프로그램에 의해 chimem artifaci를 확인하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST search program 과 RDP를 이용하여 DNA database와 유사한 sequence를 비교하였다(29). 여기에서 얻어진 염기서열과 클론들의 염기서열은 Phydit program(7)Tr 사용하여 2차 구조에 바탕을 두고 정렬하였으며, 분석된 클론의 염기서열 길이가 다를 경우 가장 짧은 것을 기준으로 하였고. 나머지 부분은 계통분석에서 제외하였다.
Korea)로 정제하였다. 유전자 서열분석은 Big-Dye Cycle Sequencing kit (PE Applied Biosystems, Foster City. CA) 와 AB I Prims 310 Genetic analyzer (PE Applied Biosystems, Foster City. CA)에 의해 수행하였으며, 유전자 서열 분석을 위해 8F primer 를 사용하였다. RDP (Ribosomal Database Project)에서 제공하는 CHECK_CHIMERA 프로그램에 의해 chimem artifaci를 확인하였고, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST search program 과 RDP를 이용하여 DNA database와 유사한 sequence를 비교하였다(29).
본 연구에서는 전남 순친만의 갯벌토양으로부터 직접 DNA를 주줄하고 eubacteria의 16S rDNA 승폭용 universal primer를 사용하여 I6S rDNA 클론 라이브리리를 제작하여 amplified rDNA restriction analysis (ARDRA)를 수행하였고. 이들 중 일부를 선별하여 16S rDNA partial sequence늘 분석하여 DNA database와 함께 비교하고 계통분석을 통하여 순천만 갯벌의 미생물구집의 다양성을 조사하였다.
5U Taq DNA polymerase를 넣고 최종 반응부피를 100 μl로 하여 95, C에서 7분간 pre-denature 시킨 후, 총 35 cycles (denaturation at 95℃ for 45 sec, annealing at 55℃ for 45 sec, extension at 72℃ for 1 min 30 sec)을 반응시킨 후 72*C에서 7 분간 더 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 분리하였으며, 분리된 DNA를 pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, Wis.)에 ligation 한 후 E. coll JM109에 형질전환시켜, ampicillin (50 ㎍/㎖)이 포함된 LB agar plate에서 blue-white colony 선별법에 의해 recombinant 클론을 선별하였다.
PCR 반응조건은 반응부피를 50 ㎕로 하여 94℃에서 5분 간 pre-denature 시킨 후, 총 25 cycles (denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 60℃ for 1 min, extension at 72℃ for 2 min)로 반응시킨 후 72, C에서 10분간 더 반응시켰다. 증폭된 rDNA의 RFLP분석은 Haelll (TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하였으며, 반응조건은 최종부피를 10 μ1로 하였고, PCR산물(최종부피 50 ㎕) 7 ㎕, 제한효소(HaeⅢ) 3 unit로 처리하여 37, C에서 overnight 반응시킨 후 4% agarose gel + EtBr (10 mg/ml)을 이용하여 7.5 V/cm로 전기영동 하였다. 50~100 bp ladder (BMA, Rockland, Maine) 를 DNA marker 로 사용하였고, multi-lane screener program (GelCompar II; Applied Maths, Belgium)을 이용하여 DNA fragment pattern을 clustering하였다.
1). 채취한 갯벌로부터 전체 핵산을 추출하기 위하여 Elsas와 Smalla ((3)의 방법을 다음과 같이 변형하여 이용하였다. 먼저 염농도를 낮추기 위해 시료 30 g이 들어있는 50 ml polypropylene tube에 15 ml의 100 mM sodium phosphate buffer (pH 8.
50~100 bp ladder (BMA, Rockland, Maine) 를 DNA marker 로 사용하였고, multi-lane screener program (GelCompar II; Applied Maths, Belgium)을 이용하여 DNA fragment pattern을 clustering하였다. 클론의 RFLP 분석에 의해서 얻어진 genetic diversity 를 추정하기 위해 coverage value (C)를 계산하였다(19).
대상 데이터
l estimated sequence divergence. E. coli ATCC 11775T served as the outgroup.
갯벌의 채집은 2000년 5월에 실시하였으며, 전남 순천시 대대동에 위치한 갯벌을 채취하였다(Fig. 1). 채취한 갯벌로부터 전체 핵산을 추출하기 위하여 Elsas와 Smalla ((3)의 방법을 다음과 같이 변형하여 이용하였다.
이론/모형
2. Dendrograms constructed from the results of ARDRA pattern and distance matrix calculated by the UPGMA method using GelCompar Ⅱ. The diversity within 16S rDNA clone libraries was further investigated by ARDRA with one restriction endonuclease Dots show the positions of sequenced clones.
Phylogenetic tree showin밤 the affiliations of 16S rDNA clone sequences to selected reference sequence of the Proteobacteria. The tree was constructed from a distance matrix by the Neighbour-Joining analysis. Bootstrap percentages higher than 50% are placed alongside the node considered.
나머지 부분은 계통분석에서 제외하였다. 계통분석은 PHYLIP 3.5 package (15)를 이용하여 Jukes & Cantor distance model (24)과 neighbor-joining method (36)에 의해 염기 서열간의 유전적 거리와 phylogentic tree를 주론하였다. 또한 bootstrap 값은 L000회의 resampled data로부터 추론하였으며(14), 20개의 클론에 대해 결정한 부분적인 염기서열들은 GenBank sequence database (http://www.
성능/효과
Sphingobacteriae] gliding mobility오!" 다양한 고분자 유기물을 분해할 수 있는 능력이 있는 Cytophaga (35.45)에 속하는 클론 (clone 103)을 조사하였으나, 염기서열 분석시 Cytophaga fennentans (M58766)와 82.1%의 유사도를 나타내었고, Cytophaga diffluens와도 유연관계를 나타내었으나, bootstrap 값은 52%로 높지 않았다(Fig. 4).
20개의 클론들을 계통분석한 결과 alpha-, delta-,Proteobacterui, low G+C Gram positive bacteria, high G+C Gram positive bacteria, Sphingobacteria {Cytopluiea). Cyanobacteria (Chloroplast) 등 7개의 수요한 lim?age로 나-누어졌다시7).
ARDRA의 결과부터 dendrogram에 따라 20개의 클론을 선별하여 partial sequencing을 수행한 결과 길이는 약 466~678 bp 정도였다. 환경시료에서 분리한 DNA로부터 16S rDNA를 증폭할 경우 chimeric artifact# 형성할 수 있으며, 이러한 현상은 혼합되어 있는 16S rDNA의 단편들이 hybrid molecule을 형성하여 이것을 주형으로 하는 PCR 반응에서 증폭되어 나타나게 된다(27).
따라서 RDP에서 제공하는 CHECK_CHIMERA 프로그램에 의해 chimera artifact# 조사한 결과 20개의 클론 sequence에서는 조사되지 않았다. Partial sequence는 phydit program으로 정 렬한 후, RDP database와 GenBank database를 이용하여 배양 가능한 미생물의 알려진 I6S rDNA sequence와 비교했을 때 어떠한 organism과도 일치하지 않았으며, 배양 가능한 미생물과의 sequences similarity는 77~96.8%였다(Table I). 그리고 ARDRA의 결과부터 cluster된 클론들은 UPGMA 분석시 유사도 85% 이 상(cluster 4; clone 53.
5 kb에 해당하는 PCR 반응산물을 확인하였고, PCR 산물을 pGEM-T Easy Vector에 삽입하여 총 111개의 클론을 얻었다. 각 클론들의 ARDRA pattern을 UP0MA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic means) 방법에 의해 분석한 결과 50% 정도의 RFLP 유사도에 따라 9개의 cluster로 나뉘어졌으며, 100개의 서로 다른 RFLP type으로 조사되었고(Fig. 2), clone number ratio [(RFLP types clone num- ber/total clone number)X 100]은 90. 1%로 내부분이 single type의 클론이었다.
8%였다(Table I). 그리고 ARDRA의 결과부터 cluster된 클론들은 UPGMA 분석시 유사도 85% 이 상(cluster 4; clone 53. 134. 136)에서는 염기서열분석 결과(Fig 3; clone 53. 134, 136)와 어느 정도 일치하였으나, 80%이하에서 cluster된 클론들은 염기서열분석 결과에 있어서는 서로 다른 lineage로 나누어져 일관되지 않았다. 따라서 ARDRA에 의해 grouping을 할 경우 유사도 값이 85% 이상에서만 유의성을 가지는 것으로 판단된다.
그러나 CsCl 와 potassium acetate 침전에 의해 정제된 DNA는 갈색을 띠었으며, PCR이 수행되지 않았다(data not shown). 따라서 humic compound들이 전기영동상에서 DNA에 비해 약 2배 정도 빠르게 이동하는 성질(6)을 이용하여 DNA의 2차 정제를 수행하였으며n 이후 얻어진 DNA는 PCR, 제한효소 처리, 클로닝을 수행하기에 적합하였다.
글온 41은 low G+C Grunvpositive bucteria group에 포함되었으며, 절대혐기성 세균인 I'hcniKtciiiiicrobdi-tc/iK/n ihennosulfunn- (X5X351)와 가장 가까운 유연관계를 나타내있다. 또한 Closiridiiim acetircduccns (X79862)와의 유연관계도 높게 나타났으며. 이늘& 각각 91%와 75%의 booisn-ap 값으로 지지되었다.
도를 나타냈다. 또한 blast search 결과 가장 높게 조사된 arid soil(ll)로부터 얻어진 uncultured soil bacterium (AF128648)과의 유사도를 조사하였으나 79%로 매우 낮았고, bootstrap 값도 51 %로 높지 않았다(Fig. 4).
또한 phytoplankton bloom 후에 발생하는 것으로 예상되고, sampling 시간에 의존하■는 allochthonous microoganisms(34)에 속 하는 1개의 chloroplast 클론(clone 291)도 조사되었는데, 이는 염 기서열 분석시 Narvicula salinicola (U96446)의 chloroplast와 96.8%의 높은 유사도를 나타내었으며, bootstrap 값도 98%로 높게 나타났다(Fig 4).
본 연구 결과로 볼 때 일반적으로 미생물 군집구조가 화학적 또는 물리적인 스트레스에 대한 반응으로서 diversity가 감소하게 되거나 변하게 된다(28)는 보고와는 달리 순천만의 경우 생활하수 등이 지속적으로 유입됨에도 불구하고 genetic diversity나 species phylogenetic diversity가 매우 높았으며, 16S rDNA partial sequence 결과 갯벌내에 존재하는 미생물군집 대부분이 배양 되지 않는 미생물로 조사되었다. 따라서 순천만의 갯벌생태계에 존재하는 미생물 군집의 구조와 기능이 매우 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, 본 실험을 통하여 순천만 생태계의 세균군 집에 대한 미생물 군집의 가시적인 구조를 보여줌으로 순천만 갯벌에 대한 미생물 생태계를 이해하는데 도움이 될 것이라고 사료된다.
Gray와 Herwing (20)은 marine sediment로부터 미생물 군집을 조사했을 때 6개의 주요한 bacteria group으로, Urakawa 등(40)은 5개의 주요한 bacteria group으로 나누었으며, 이들의 결과에 의하면 marine sediment에서는 gamma Proteobacteria와 Grampositive bacteria가 우세하다고 보고하고 있다. 본 연구에서는 분자생물학적인 방법을 이용하여 순천만 갯벌내의 미생물 군집을 조사한 결과 delta Proteobacteria와 gamma Proteobacteria가 우점종을 차지하고 있었고, alpha PmteohacteriaSL 확인할 수 있었으며, ARDRA의 결과 genetic diversity도 marine sediment보다 더 다양하다는 것을 추정할 수 있었다. 그러나 미생물 군집구조 분석 및 시·공간적 역동성을 파악하기 위해서는 클론과 염기서열의 대상수가 많아야 하고 또한 이를 분석하기 위해 소요되는 시간과 비용이 많이 든다는 단점과 미생물 다양성을 분석하는데 있어서 매우 다양한 관점 즉, 영양상태, 생리적 또는 기능적 다양성, 종내, 종간 또는 상위분류군의 계통 다양성 등에 대한 모든 level에서 고려되어야 한다(10)는 관점에서 볼 때 보다 더 구체적인 군집구조를 제시하지는 못했다.
Moyer 등(1994)은 ARDRA에 의해 심해 열수구의 microbial mat community를 조사하였는데, 48개의 클론들로부터 12개의 서로 다른 RFLP type을 얻었으며 이들 중 2가지 클론 type이 우세하다는 보고를 했다. 실험결과가 현장에 실제로 존재하는 세균 군집을 반영하는 비율을 의미하는 coverage value (C)도 순천만의 경우 19%로 매우 낮았다. Urakawa 등(40)은 SA, SB, TK의 marine sediment로부터 ARDRA pattern을 조사한 결과 SA에서는 72 클론들 중 57개의 서로 다른 RFLP type을, SB에서는 62 클론들 중 17개의 RFLP type, TK에서는 58 클론들 중 21개의 RFLP type을 나타낸다고 보고했으며, 이들의 coverage value (C)를 계산한 결과 SB와 TK는 각각 84%, 74%로 비슷한 value를 나타내었으나, SA에서는 45%로 낮았다고 보고하고 있다.
위의 연구들이 2~3개의 제한효소를 사용해서 얻어진 결과인데 반하여 본 실험에서는 한 종류의 제한효소를 사용했는데도 거의 모든 클론들이 다른 pattern으로 나타나는 것으로 보아 갯벌내 미생물의 genetic diversity가 매우 높은 것으로 조사되었다. 일반적으로 미생물 군집구조는 화학적 또는 물리적인 스트레스에 대한 반응으로서 diversity가 감소하게 되거나 변하게 된다(28).
5%의 유사도를 나타내었으며, 클론 41과 마찬가지로 low G+C Gram positive bacteria group에 포함되는 것으로 나타났다. 이 두 클론은 Thennoluih)bacter berrensix (AFU3543)와 삭삭 78%와 79%의 염기서열 유사도로서 현재까지 알려진 세균 중에서는 가장 높은 염기서열 유사도를 보였으나, 계통분석에서는 유연관계가 높지 않은 것으로 나타났고, 또한 cold marine(34)으로부터 얻어진 uncultured HolophagalAcidobacterium (AJ241003)과도 86%의 낮은 유사도를 나타내었다(Fig. 4). 클론 37은 high G+C Gram-positive bacteria groupe과 가까운 유연관계를 보였으며, 배양 가능한 미생물과의 염기서열 분석시 유사도가 가장 높은 세균은 ProHiicFoinoHospom enterophila (XX3XO7)로 조사되었으나 77%으] 낮은 유-사.
Cyanobacteria (Chloroplast) 등 7개의 수요한 lim?age로 나-누어졌다시7). 이들 중 14개의 글론이 Proteobacteria (alpha, delta, gamma)에 속했으며, delta Proteobacteria의 대부부은 sulfur-reducing에 관여하는 bacteria와 유연관계를 가지고 있었으미, similarity value는 86~89%였다. 또한 gamma Proteobacteria는 blast search 결과 대부분이 sulfur-oxidizing symbiotic bacteria와- 관계되었으나 배양 가능한 균주 중에서는 게통분류학적으로 유사한 균주가 없기 때문에 생리적인 특성을 정확히 예측할 수 없었다(Fig.
이늘& 각각 91%와 75%의 booisn-ap 값으로 지지되었다. 클론 155와 230은 ARDRA 분석에서 동일한 제한효소 절단모양을 나타낸 클론으로서 염기서열 분석에서 96.5%의 유사도를 나타내었으며, 클론 41과 마찬가지로 low G+C Gram positive bacteria group에 포함되는 것으로 나타났다. 이 두 클론은 Thennoluih)bacter berrensix (AFU3543)와 삭삭 78%와 79%의 염기서열 유사도로서 현재까지 알려진 세균 중에서는 가장 높은 염기서열 유사도를 보였으나, 계통분석에서는 유연관계가 높지 않은 것으로 나타났고, 또한 cold marine(34)으로부터 얻어진 uncultured HolophagalAcidobacterium (AJ241003)과도 86%의 낮은 유사도를 나타내었다(Fig.
4). 클론 37은 high G+C Gram-positive bacteria groupe과 가까운 유연관계를 보였으며, 배양 가능한 미생물과의 염기서열 분석시 유사도가 가장 높은 세균은 ProHiicFoinoHospom enterophila (XX3XO7)로 조사되었으나 77%으] 낮은 유-사.도를 나타냈다.
후속연구
본 연구 결과로 볼 때 일반적으로 미생물 군집구조가 화학적 또는 물리적인 스트레스에 대한 반응으로서 diversity가 감소하게 되거나 변하게 된다(28)는 보고와는 달리 순천만의 경우 생활하수 등이 지속적으로 유입됨에도 불구하고 genetic diversity나 species phylogenetic diversity가 매우 높았으며, 16S rDNA partial sequence 결과 갯벌내에 존재하는 미생물군집 대부분이 배양 되지 않는 미생물로 조사되었다. 따라서 순천만의 갯벌생태계에 존재하는 미생물 군집의 구조와 기능이 매우 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, 본 실험을 통하여 순천만 생태계의 세균군 집에 대한 미생물 군집의 가시적인 구조를 보여줌으로 순천만 갯벌에 대한 미생물 생태계를 이해하는데 도움이 될 것이라고 사료된다.
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