위염 및 위궤양, 심이지장궤양, 위암의 주요한 발병 원인균으로 알려져 있는 Helicobacter pylori의 생육을 특이적으로 억제하는 유산균을 선발하기 위해서, 45종의 유산균에 대하여 paper disk법을 이용한 항균 효과, Caco-2세포에 대한 정착능, urease activity법을 이용한 H. pylori 억제능 등을 파악하고, 유산균 배양액과 H. pylori의 동시배양에 따른 요소 분해효소의 활성 변화와 우유 발효능 등을 실험하였다. H. pylori의 생육을 억제하는 물질의 생성 유무를 확인하기 위하여 paper disk법으로 유산균 배양액에 의한 H. pylori의 생육 억제환을 측정한 결과, 28종의 유산균에서 생육 억제환이 형성되었다. 대부분이 유산 생성에 의한 낮은 pH 때문인 것으로 판단되지만, 일부 균종에서는 항균성 물질에 의한 억제환이 형성되었다. 다른 유산균에 비해서 생육 억제환이 가장 큰 Lactobacillus gasseri MK-03 균주가 H. pylori에 대한 항균 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 항균 활성을 나타낸 28종의 유산균을 대항으로 Caco-2 세포에 대한 정착능을 실험한 결과, 18종의 유산균에서 정착능이 확인되었으며, Bifidobacterium longum MK-26 균주가 가장 우수한 것으로 나타났다. 특히 반응 2시간 전에 미리 Caco-2 세포에 정착시켰을 때, H. pylori의 정착율은 0.105%에서 0.004%로 감소되었다. 한편 요소 분해효소 활성을 저해하여 H. pylori를 억제하는 유산균을 선발하기 위해서 항균활성이 인정되는 28종의 유산균을 대상으로 실험한 결과, 21종의 유산균에서 요소 분해효소 활성의 저해 효과가 나타났으며, 이중에서 Lb. acidophilus MK-07 균주가 가장 우수한 것으로 판명되었다. 따라서 Lb. gasseri MK-03 균주는 항균 활성에서, Lb. acidophilus MK-07 균주는 요소 분해효소의 활성 억제에 의해서, Bif. longum MK-26 균주는 정착능 저해에 있어서 각각 우수한 H. pylori 생육 억제능을 나타냈다. 한편 최종적으로 선발된 3종의 유산균과 대조균주로서 13종의 유산균에 대해서는 우유 배양실험을 실시한 결과, 3종의 선발균주 모두가 발효유 제품에의 응용 적합성을 나타냈다.
위염 및 위궤양, 심이지장궤양, 위암의 주요한 발병 원인균으로 알려져 있는 Helicobacter pylori의 생육을 특이적으로 억제하는 유산균을 선발하기 위해서, 45종의 유산균에 대하여 paper disk법을 이용한 항균 효과, Caco-2세포에 대한 정착능, urease activity법을 이용한 H. pylori 억제능 등을 파악하고, 유산균 배양액과 H. pylori의 동시배양에 따른 요소 분해효소의 활성 변화와 우유 발효능 등을 실험하였다. H. pylori의 생육을 억제하는 물질의 생성 유무를 확인하기 위하여 paper disk법으로 유산균 배양액에 의한 H. pylori의 생육 억제환을 측정한 결과, 28종의 유산균에서 생육 억제환이 형성되었다. 대부분이 유산 생성에 의한 낮은 pH 때문인 것으로 판단되지만, 일부 균종에서는 항균성 물질에 의한 억제환이 형성되었다. 다른 유산균에 비해서 생육 억제환이 가장 큰 Lactobacillus gasseri MK-03 균주가 H. pylori에 대한 항균 활성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 항균 활성을 나타낸 28종의 유산균을 대항으로 Caco-2 세포에 대한 정착능을 실험한 결과, 18종의 유산균에서 정착능이 확인되었으며, Bifidobacterium longum MK-26 균주가 가장 우수한 것으로 나타났다. 특히 반응 2시간 전에 미리 Caco-2 세포에 정착시켰을 때, H. pylori의 정착율은 0.105%에서 0.004%로 감소되었다. 한편 요소 분해효소 활성을 저해하여 H. pylori를 억제하는 유산균을 선발하기 위해서 항균활성이 인정되는 28종의 유산균을 대상으로 실험한 결과, 21종의 유산균에서 요소 분해효소 활성의 저해 효과가 나타났으며, 이중에서 Lb. acidophilus MK-07 균주가 가장 우수한 것으로 판명되었다. 따라서 Lb. gasseri MK-03 균주는 항균 활성에서, Lb. acidophilus MK-07 균주는 요소 분해효소의 활성 억제에 의해서, Bif. longum MK-26 균주는 정착능 저해에 있어서 각각 우수한 H. pylori 생육 억제능을 나타냈다. 한편 최종적으로 선발된 3종의 유산균과 대조균주로서 13종의 유산균에 대해서는 우유 배양실험을 실시한 결과, 3종의 선발균주 모두가 발효유 제품에의 응용 적합성을 나타냈다.
This study was conducted to select lactic acid bacteria which possess potential inhibitory effect on Helicobacter pylori, and to make feasibility test of fermented milk products using them. In order to select lactic acid bacteria specifically inhibiting the growth of H. pylori, antibacterial activit...
This study was conducted to select lactic acid bacteria which possess potential inhibitory effect on Helicobacter pylori, and to make feasibility test of fermented milk products using them. In order to select lactic acid bacteria specifically inhibiting the growth of H. pylori, antibacterial activity using paper disk method, adherence ability to Caco-2 cell inhibitory effect on urease activity of H. pylori, and milk fermentation feasibility were measured. Among 45 strains of lactic acid bacteria tested, 28 strains showed clear zone and Lactobacillus gasseri MK-03 showed the largest clear zone. Caco-2 cell adherence by lactic acid bacteria and inhibitory effect of them on H. pylori adherence were also evaluated. Of 28 strains tested, 18 strains appeared to be effective on adherence to Caco-2 cell, and especially Bifidobacterium longum MK-26 was found to be superior to others. When Bif. longum MK-26 and H. pylori were reacted with Caco-2 cell 2hrs before, adherence percentage of H. pylori decreased from 0.105% to 0.004%. To investigate inhibitory effect of lactic acid bacteria-derived supernatant on urease activity of H. pylori, pH-adjusted fermented supernatant(pH-4.4) was assessed by co-cultivation method. There of Lb. acidophilus MK-07-derived supernatant showed the most inhibitory effect on urease activity of H. pylori. Considering milk fermentation ability of selected 3 strains, they were comparably feasible to fermented milk products. Consequently, Lb. gasseri MK-03, Lb. acidophilus MK-07, and Bif. longum MK-26 were selected to specifically inhibit the growth of H. pylori, by antibacterial activity, inhibition of urease activity, and inhibition of Caco-2 cell adherence, respectively.
This study was conducted to select lactic acid bacteria which possess potential inhibitory effect on Helicobacter pylori, and to make feasibility test of fermented milk products using them. In order to select lactic acid bacteria specifically inhibiting the growth of H. pylori, antibacterial activity using paper disk method, adherence ability to Caco-2 cell inhibitory effect on urease activity of H. pylori, and milk fermentation feasibility were measured. Among 45 strains of lactic acid bacteria tested, 28 strains showed clear zone and Lactobacillus gasseri MK-03 showed the largest clear zone. Caco-2 cell adherence by lactic acid bacteria and inhibitory effect of them on H. pylori adherence were also evaluated. Of 28 strains tested, 18 strains appeared to be effective on adherence to Caco-2 cell, and especially Bifidobacterium longum MK-26 was found to be superior to others. When Bif. longum MK-26 and H. pylori were reacted with Caco-2 cell 2hrs before, adherence percentage of H. pylori decreased from 0.105% to 0.004%. To investigate inhibitory effect of lactic acid bacteria-derived supernatant on urease activity of H. pylori, pH-adjusted fermented supernatant(pH-4.4) was assessed by co-cultivation method. There of Lb. acidophilus MK-07-derived supernatant showed the most inhibitory effect on urease activity of H. pylori. Considering milk fermentation ability of selected 3 strains, they were comparably feasible to fermented milk products. Consequently, Lb. gasseri MK-03, Lb. acidophilus MK-07, and Bif. longum MK-26 were selected to specifically inhibit the growth of H. pylori, by antibacterial activity, inhibition of urease activity, and inhibition of Caco-2 cell adherence, respectively.
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문제 정의
pylori의 생육을 억제하기 위해서는 기본적으로 항균 활성, 정착성, 내산성, 유산 생성능, 요 소 분해효소의 활성 저하능 등이 우수하여야 한다. 따라서 본 연구에서는 유산균의 항균 효과, 정착능, 요소 분해효소의 활성 저 하능 등을 파악하여 H. pylori에 대한 생육 억제능 효과가 우수한 프로바이오틱 유산균주를 선발하고, 우유 발효성과 안정성을 확인하여 발효유 제품에 이용하는데 그 목적이 있다.
pylori 생육에 미치는 영향을 실험한 결과에서 유산, 초산. 염산 등이 농도 의존형 방식으로 H. pyloriS] 생육을 억제하는 것으로 보고하였 는데. 유산이 가장 높은 억제 활성을 나타냈다.
Caco-2 세포에 대한 정착능 비교를 위해서 Konishi 등(16)의 방법을 응용하여 실험하였다. 24-well plate에 monolayer가 형성된 Caco-2 세포를 PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.
Paper disk법과 urease activity 저하능 실험을 위해서 각각의 유산균 배양액을 원심분리(3, 000 rpm, i0 min)하여 상등액을 취한 후, 성장 정도를 간접적으로 알아보기 위하여 pH를 측정하였다. pH에 의한 실험오차를 줄이기 위하여 2N NaOH 또는 lactic acid 를 사용하여 pH를 4.
Lee 등(18)은 Lb. cieidtipliilus가 H. priori의 성착능을 저해하는 활성에 대해서 실험하였는.데.
pylori에 대한 유산균의 항균 활성을 측정하기 위한 실험 조건은 다음과 같다. 미리 준비된 유산균 배양액 60 μl를 H. pylon 균주가 표면도말된 modified Colombia agar (7% horse serum, 0.4% Campylobacter selective complement 함유; Oxoid, England) 위의 paper disk (10mm diameter; Toyo Roshi Kaisha, Japan)에 주입한 후, 10% CO2 incubator에서 37℃로 배양했을 때 형성된 생육 억제환의 크기를 측정하여 H. pylori에 대한 항균 활성을 확인하였다.
요소 분해효소의 활성 측정에 의한 유산균의 H. pylori 억제능을 실험하기 위해서 H. pylori 배양액을 원심분리(3, 000 rpm, 10 min)하여 PBS로 2회 세척한 후, 배양하지 않은 신선한 BHI medium으로 동량 mass up하였다. 한편 배양하지 않은 신선한 BHI medium이 함유된 24-well plate에 유산균 배양상등액을 각각 0%, 10%, 20%씩 첨가하고, 준비된 H.
pylori 배양액을 원심분리(3, 000 rpm, 10 min)하여 PBS로 2회 세척한 후, 배양하지 않은 신선한 BHI medium으로 동량 mass up하였다. 한편 배양하지 않은 신선한 BHI medium이 함유된 24-well plate에 유산균 배양상등액을 각각 0%, 10%, 20%씩 첨가하고, 준비된 H. pylori 배양액을 2% 접종하여 10% CO2 incubator에서 37℃, 15시간동안 배양하였다. 요소 분해효소의 활성을 측정하기 위해서 반응용액 200 μl와 상기의 시료 10 μl를 혼합하여 23℃에서 30분동안 반응시킨 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
본 실험에는 현재 산업적으로 널리 사용되고 있는 유산균주, 표준균주 및 매일유업(주) 중앙연구소에 보존 중인 lactobacilli 22종, streptococci 7종, bifidobacteria 16종을 사용하였다. 실험에 사용된 streptococci는 M-17 broth (Difco, USA)에서 37℃, 24시 간동안 호기적으로 배양하였으며, lactobacilli와 bifidobacteria는 modified MRS broth (0.
본 실험에는 현재 산업적으로 널리 사용되고 있는 유산균주, 표준균주 및 매일유업(주) 중앙연구소에 보존 중인 lactobacilli 22종, streptococci 7종, bifidobacteria 16종을 사용하였다. 실험에 사용된 streptococci는 M-17 broth (Difco, USA)에서 37℃, 24시 간동안 호기적으로 배양하였으며, lactobacilli와 bifidobacteria는 modified MRS broth (0.05% L-cysteine-HCL 0.01% calcium chloride, 0.02% sodium carbonate 함유; Difco, USA)에서 37℃, 24시간동안 혐 기배양하였다. 한편 대조균주로 사용한 H.
이론/모형
acidophilus MK-07, Bif. longum MK-26 균주가 H. pylori와 Caco-2 세포에 동시 반응되었을 때의 실질적인 정착 억제능을 확인하기 위하여 동시반응법을 사용하였으며, 그 결과는 Table 3와 같다. 단독 정착반응시 3종의 유산균 모두가 정착능이 우수하였으며 특히 Lb.
성능/효과
pylori 요소 분해효소의 활성 억제능 실험 결과는 Table 4와 5에 나타냈다. 28종 유산균의 배양상등 액에 의한 H. pylori 요소 분해효소의 활성 억제 효과는 배양 상등액 10% 함유 시료에서는 7종의 유산균을 제외한 나머지 유산균에서 억제능이 나타났지만, 배양상등액 을 20% 함유하는 시료에서는 모든 유산균이 H. pylori를 완전하게 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 유산균이 H.
pyloriS] 정칙을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려져 있기 때문에 유산균의 Caco-2 세포 정착능을 확인한 결과는 Table 2와 같다. 28종의 유산균을 실험한 결과 18종의 유산균에서 정착능이 확인되었으며, MK-02. MK-03.
pylorie 대한 정착 억제능은 Bif. longum MK-26 균주가 가장 우수한 것으로 나타났다.
acidophilus MK-07, Bif. longum MK-26 균주의 배양상등액 농도와 H. pylori의 배양시간에 따른 요소 분해효소 활성의 저하 효과를 실험한 결과, 배양상등액 5%에서는 별다른 효과를 보이지 못하였지만, 배양상등액 10% 첨가 시에는 배양시간이 증가할수록 요소 분해효소에 대한 활성 저 하능이 나타났다.
이중에서도 Bif. longum MK-26 균주의 정착율은 10% 이상으로서 매우 월등한 것으로 나타났다.
pylori의 생육을 특이적으로 억제하는 유산균을 선발하기 위해서 paper disk법을 사용하여 유산균의 항균 활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다. pH와 유산에 의한 실험오차를 줄이기 위해서 유산과 2N NaOH를 사용하여 유산균 배양상등액의 pH 를 4.4로 보정하여 실험한 결과, 유산균 균종별로 보면 streptococci가 lactobacilli와 bifidobacteria에 비해서 생육 억제환의 크기가 작게 나타났다. MK-03, MK-05, MK-07, MK-I1, MK-17, MK-26, MK-27.
그 결과 경구투여된 Lb. salivarius가 유산을 생성하여 H. pylori를 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 밝혀 냈다.
모든 선발균주에서 생균수 및 유산 생성능이 양호하였으며 관능검사 결과도 양호한 풍미를 제공하는 것으로 나타났다. 따라서 이들 선발균주를 이용한 발효유 제품은 H. pylori의 예방 및 치료식으로 응용이 가능하다는 것을 알 수 있다.
생균수에 대한 결과는 Table 6 와 같다. 모든 선발균주에서 생균수 및 유산 생성능이 양호하였으며 관능검사 결과도 양호한 풍미를 제공하는 것으로 나타났다. 따라서 이들 선발균주를 이용한 발효유 제품은 H.
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