[논문]Bacillus Subtilis W700에서의 Staphylpkinase 대량생산을 위한 배지 최적화 및 배양방법의 비교

박인석; 김병기

문제 정의

보고되었다. 본 연구 결과는 이 후에 수행하여 얻어진유가식 배양에서의 만족할 만한 결과에(9) 대한 예비 실험으로써 시기적으로 발표가 늦은 감이 있으나, 전체 연구에 있어서 중요하 위치를 차지하는 부분이므로 발표를 하게 되었다.
355 g/min), DO가 30% 이하 일 때는 공급속도를 줄이거나 중지하는 방식으로 포도당을 공급하는 유가식 배양을 수행하였다. 이러한 운전방식을 채택한 이유는 발효조 안의 포도당 농도가 1-2 g/L로 유지되면서 재조합 균주의 성장은 저해를 받지 않고, P43 promoter의 발현 능이 최적이 되는 대수증식기 말기와 같은 상태를 유지시켜 줌으로서 SAK 생산을 높은 상태로 유지할 수 있게 함과 동시에 포도당이 고갈됨으로 인한 포자형성을 억제하기 위해서이다. Figure 4 (A)는 DO 농도를 30% 정도로 유지함으로서 균주가 포자로 전환되지 않고, 21 hr 동안 계속해서 성장함을 보여주고 있다.

가설 설정

(A) Time course of the cell growth of different glucose concentration. (B) Effect of glucose concentration and culture time on SAK production. M; standard marker, 1-5 were sampled at 8 hr and 6-9 were sampled at 24 hr.

제안 방법

본 연구에서는 7가지의 protease 가 제거된 B. subtilis WB700를 숙주세포로 이용하여 SAK 발현을 수행하였다. 최적화된 생산시스템을 구축하고자 발효 배지 최적화를 통하여 탄소 원과 질소원의 종류 및 농도를 찾고, 이러한 최적 배지 조건을 이용하여 유가식 배양을 수행하여 SAK 생산 극대화를 꾀하였다.
subtilis WB700를 숙주세포로 이용하여 SAK 발현을 수행하였다. 최적화된 생산시스템을 구축하고자 발효 배지 최적화를 통하여 탄소 원과 질소원의 종류 및 농도를 찾고, 이러한 최적 배지 조건을 이용하여 유가식 배양을 수행하여 SAK 생산 극대화를 꾀하였다.
회분식 배양이나 유가식 배양을 위하여는 Media 1 (Ml)배지, Super Rich (SR)배지, 그리고 Modified Super Rich (MSR) 배지 등을 사용하였다. Ml 배지는 30 g/L glucose(따로 멸균 후 혼합), 20 g/L tryptose, 10 g/L yeast extract, 5 g/L (NHQ2SO₄, 5 g/L Casamino acid, 10 g/L NaCl과 salt mixture로서 MgSO₄ 0.3 mM, K2HPO₄ 1.3 mM, NazHPO, 79.6 mM, NaH₂PO₄ 38.4 mM이며 pH는 7.5로 조정하였다. SR 배지는 tryptose 25 g/L, yeast extract 20 g/L, K2HPO₄ 3 g/L, 그리고 glucose의 경우 30 g/L를 첨가하였다.
채취한 후 -20℃에서 보관하였다. 배양액의 상등액에 존재하는 총단백질 양의 측정은 Bio-Rad사의 Bradford kit를 사용하였다. SAK 농도는 10 μL의 시료 상등액을 SDS-PAGE로 분리한 후 Pharmacia사의 UltraScan KL densitometer를 이용하여 gel 상의 band 농도를 측정하였다.
배양액의 상등액에 존재하는 총단백질 양의 측정은 Bio-Rad사의 Bradford kit를 사용하였다. SAK 농도는 10 μL의 시료 상등액을 SDS-PAGE로 분리한 후 Pharmacia사의 UltraScan KL densitometer를 이용하여 gel 상의 band 농도를 측정하였다.
10 mg/L kanamycin 이 포함된 LB 배지 50 mL에 glycerol 50% 배지용액에 보관된 stock culture-g- 1% v/v로 접종하여 rotary shaking incubator (VS-8482SR, Vision Scientific Co. Ltd.)에서 대수 성장기 후반까지 배양한 후 (O.D. 1.5 - 2.0) 1.5 L의 MSR 배지가 포함된 3.4 L New Brunswick BIOFLO lie 발효조에 접종하였다. 회분식 배양의 경우는 배양 온도 37℃, pH는 6.
나머지 조건은 회분식 배양과 동일하게 하였다. 배지내의 포도당 농도는 매 30분마다 Glucose Kit (Sigma)를 이용하여 분석하였다.
본 실험에 이용되는 WB700은 7가지의 주요 protease가 제거된 균주이기 때문에 보다 적절한 짐소원의 공급이 SAK 고농도 생산에 가장 중요한 역할을 한다. 이러한 질소원에 따른 균주의 성장과 SAK 발현량과의 관계를 좀 더 자세히 알아보기 위하여 SR 배지 내의 질소원을 여러 가지로 바꾸어 가며 SAK 발현을 관찰하였다. Figure 1 (A)는 질소원으로서 tryptose, tryptone, (NH₄)2SO₄, 그리고 soy bean을 사용하였을 때의 SAK 발현양을 SDS-PAGE로 분석한 결과인더], tryptone을 질소원으로 사용하였을 때에 다른 질소원에 비하여 현격한 발현 증가를 보임을 알 수 있다.
B. s姑血is에 널리 이용되는 배지의 하나인 SR 배지와 이 배지의 질소원인 tryptose를 trytone으로 바꾼 MSR 그리고 본 연구실에서 설계한 Ml배지, 이렇게 세 종류의 배지를 이용하여 B. subtilis WB700[pSAKP]를 배양하였다. Figure 2는 상기한 세 가지 종류의 배지에서 증식하는 SAK 생산 균주의 성장곡선을 나타낸 것이다.
sm버ilis를 이용한 재조합 단백질 고발현에 매우 중요하다. 먼저 플라스크 수준에서의 SAK 발현을 위한 최적 포도당 농도를 알아보았다. Figure 3 (A)는 포도당 농도에 따른 WB700 [pSAKP]의 생장곡선을 나타낸 것이다.
5 g/L 혹은 10 g/L 일 경우에는 동일한 비성장속도를 보인 반면에 20 g/L 이상에서는비성장속도 및 최종세포농도가 낮아짐을 알 수 있었다. 이때 각각의 포도당 농도에서의 SAK 발현정도를 SDS-PAGE를 통하여 알아보았다. Figure 3 (B) 결과에서 10 g/L 까지는 SAK 발현이 증가 하지만 그 이상에서는 더 이상 증가하지 않음을 알 수 있었다.
앞의 실험결과를 토대로 하여 유가식 배양에 사용한 배지 조성은 SR 배지 중에서 tryptose 대신에 tryptone으로 바꾼 것을 사용하였으며 이것을 Modified Super Rich (MSR) 배지라 명명하였다. 외부에서 첨가해 주는 배지는 농축 포도당(200 g/L) 을 이용하여 공급하였다.
외부에서 첨가해 주는 배지는 농축 포도당(200 g/L) 을 이용하여 공급하였다. 유가식 발효를 위한 배지내의 포도당 (200 g/L 용액) 공급은 New Brunswick BIOFLO He 발효기 내에 장착된 AFS 프로그램을 이용하여 DO가 30% 이상일 때 농축 포도당을 공급하고 (평균유속 0.355 g/min), DO가 30% 이하 일 때는 공급속도를 줄이거나 중지하는 방식으로 포도당을 공급하는 유가식 배양을 수행하였다. 이러한 운전방식을 채택한 이유는 발효조 안의 포도당 농도가 1-2 g/L로 유지되면서 재조합 균주의 성장은 저해를 받지 않고, P43 promoter의 발현 능이 최적이 되는 대수증식기 말기와 같은 상태를 유지시켜 줌으로서 SAK 생산을 높은 상태로 유지할 수 있게 함과 동시에 포도당이 고갈됨으로 인한 포자형성을 억제하기 위해서이다.

대상 데이터

SAK 발현을 위하여 pSAKP 플라스미드를 함유한 Bacillus subtilis WB700 (trpC₂ nprE aprE epr bpf Jmpr::ble J nprB::bsr Jvpr::ery) 균주를 이용하였다<9). pSAKP 플라스미드는 P43 promoter에 의하여 SAK을 발현한다.
subtilis 배양시 seed culture는 LB배지 (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, Nacl 10 g/L)를 사용하였고, 플라스미드를 가진 균주를 유지할 수 있도록 kanamycin 10 g/L를 사용하였다. 회분식 배양이나 유가식 배양을 위하여는 Media 1 (Ml)배지, Super Rich (SR)배지, 그리고 Modified Super Rich (MSR) 배지 등을 사용하였다. Ml 배지는 30 g/L glucose(따로 멸균 후 혼합), 20 g/L tryptose, 10 g/L yeast extract, 5 g/L (NHQ2SO₄, 5 g/L Casamino acid, 10 g/L NaCl과 salt mixture로서 MgSO₄ 0.
따라서 여러종류의 protease를 분비하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에 이용되는 WB700은 7가지의 주요 protease가 제거된 균주이기 때문에 보다 적절한 짐소원의 공급이 SAK 고농도 생산에 가장 중요한 역할을 한다. 이러한 질소원에 따른 균주의 성장과 SAK 발현량과의 관계를 좀 더 자세히 알아보기 위하여 SR 배지 내의 질소원을 여러 가지로 바꾸어 가며 SAK 발현을 관찰하였다.

이론/모형

SAK 활성 측정은 2단계법인 plasminogen-coupled chromogenic substrate assay를 사용하였다<4). SAK의 활성은 1 mL의 시료 상등액에서 1분간 변화하는 흡광도 차이(405nm에서 측정)를 1 unit로 정의하였다.

성능/효과

Figure 1 (A)는 질소원으로서 tryptose, tryptone, (NH₄)2SO₄, 그리고 soy bean을 사용하였을 때의 SAK 발현양을 SDS-PAGE로 분석한 결과인더], tryptone을 질소원으로 사용하였을 때에 다른 질소원에 비하여 현격한 발현 증가를 보임을 알 수 있다. SAK을 대량으로 생산하기 위하여는 가급적이면 저가의 질소원을 사용할 필요가 있기 때문에 soy bean을 질소원으로 사용하였으나, 생산 상의 문제가 아닌 분리상의 문제를 야기하기 때문에 질소원후보로써 적합하지 않음을 알 수 있었다. 이러한 질소원의 최적 농도를 알아보기 위하여 여러가지 농도의 tryptone를첨가하여 Figure 1 (B)와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
Figure 3 (A)는 포도당 농도에 따른 WB700 [pSAKP]의 생장곡선을 나타낸 것이다. 포도당 농도가 증가할수록 균주의 생장 속도는 어느 정도 감소함을 알 수 있었다. 5 g/L 혹은 10 g/L 일 경우에는 동일한 비성장속도를 보인 반면에 20 g/L 이상에서는비성장속도 및 최종세포농도가 낮아짐을 알 수 있었다.
이러한 현상은 SAK 생산 균주가 심한 기질 저해를 받지 않는 수준에서 높은 비성장속도를 가지는 것이 발현에도 긍정적인 효과를 끼친다는 것을 의미하는 것이다. 또한 배양 시간을 적절하게조절함으로써 이미 발현된 SAK의 분해를 방지할 수 있는 것으로 SDS-PAGE 결과에서 알 수 있었다.
한가지는 pH이다. 플라스크 배양 수준에서 초기 pH 를 6.7, 7.0, 7.3로 변화시킨 후 재조합 균주의 생장 및 SAK 발현을 관찰한 결과, 24시간이 지났을 때 최종 pH는 각각 6.3, 6.5, 6.6으로 변했으며, pH 7.3 일때 재조합 균주의 생장 및 SAK 발현이 가장 높았다 (data not shown).
Figure 4 (A)는 DO 농도를 30% 정도로 유지함으로서 균주가 포자로 전환되지 않고, 21 hr 동안 계속해서 성장함을 보여주고 있다. 그러나, DO 농도에 따른 매우 정밀한 포도당 공급속도 조절이 되지 않음으로 인하여 4 hr 부근과 14시간 부근에 배지 내의 포도당 농도가 고갈되고, 이로 인한 스트레스를 받음으로써 SAK 발현 균주의 대수 증식과정이 종결됨을 알 수 있다. Figure 4 (B)는 유가식배양시 시간에 따른 SAK 발현정도를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
이러한 이유는 SAK을 발현시키기 위하여 사용한 P43 promoter의 특징(12)과 더불어, MSR 배지를 사용한 경우는 유가식배양을통해 회분식배양과 비교해서 한층 높은 세포농도를 얻을 수 없었던 것이 주요 원인이라고 생각한다. 이를 정밀하지 못한 on-line feeding 시스템의 문제로 야기된 결과로 볼 수도 있지만, 세포 농도를 높이기 위해 순수 산소만을 이용하여 배양한 경우에도 공기만을 이용하여 배양한 경우보다 높은 세포 농도를 얻을 수 없었으며, MSR 배지보다 1.5-2 배 정도의 yeast extract, 질소원, 탄소원 등을 변화시켜도 역시 같은 결과를 얻게되었다(data not shown), 질소원이나 yeast extract 농도를 낮추면서 유가식 배양을 한 경우는 세포농도는 물론 SAK농도도 낮았으며, 탄소원 공급 유속을 변화시키며 배양한 결과도 회분식 배양에서보다 높은 세포농도를 얻을 수 없었다. 이를 종합해보면, B.
Figure 2는 상기한 세 가지 종류의 배지에서 증식하는 SAK 생산 균주의 성장곡선을 나타낸 것이다. Ml배지에서 가장 낮은 비성장속도와 최종세포농도를 보였으며, SR와 MSR 배지는 거의 동일한 비성장속도와 최종세포농도를 보였다. 5 g/L 의 tryptose 가 (NHESCh로 치환된 Ml배지에서의 낮은 비성장 속도는 tryptose가 (NHeSOj 보다는 세포 성장에 좋은 질소원이며, tryptose와 tryptone의 세포 성장 속도에 대한 영향은 그리 크지 않음을 알 수 있다.

후속연구

이를 종합해보면, B.、wb湖s에서 P43 promoter를 사용하여 SAK를 생산할 경우는, 이 promoter가 대수증식기 중반부터 시작하여 후반에 이르러 최고의 발현능을 보이는 promoter이기 때문에(12) 회분식에서 적절한 시간까지만 배양을 한 후 생성물을 분리해 낸다면 단백질의 분해를 최소화한 고농도의 SAK을 얻을 수 있으리라 사료된다.

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