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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전통장류에서 항균 물질 및 유용 효소들을 생산하고, biogenic amine을 생성하지 않는 B. subtilis 를 분리하고, 통계학적 기법인 반응표면분석법을 기반으로 균체량의 최적화를 통하여 산업적 적용이 가능한 최적의 배지 조성을 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 100 μM DPPH Ethanol용액 1 ml에 200 μl의 배양 상등액을 가한 다음 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 시킨 후 528 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (SPECORD 200, Analytic jena)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다.
- Biogenic amine 검출용 고체 배지는 0.25% glycerol, 0.006% bromocresol purple (BCP, Sigma-aldrich), 0.1% histidine과 tyrosine (Sigma-aldrich)이 함유되어있는 LB agar (pH 5.0) 배지를 제조하여 사용하였고, 멸균증류수로 3회 세척한 균체를 8 mm ADVANTEC paper disc (Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)에 10 μl씩 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
- Biogenic amine 비생성 및 세포외 효소 생성능이 우수한 균주 86종을 대상으로 항균활성을 확인하기 위해 13종의 병원성 그람양성 및 음성 세균이 포함되어있는 0.8% soft agar plate에 well diffusion 방법을 통한 생육저지대 측정법으로 항균 활성여부를 조사하였다. 현재까지 전통 장류 유래 미생물의 항균활성에 대한 연구는 전통된장에서 분리한 균주가 E.
- 분리 미생물이 균체외로 방출하는 세포외 효소들 중 protease, cellulase의 활성 검증을 위하여 well diffusion 방법을 이용하였고, 각 효소와 특이적으로 반응할 기질의 성분이 포함된 고체 선별배지를 사용하였다. Protease 분비능은 skim milk를 기질로 선택하여 2%의 skim milk (DifcoTM)에 1.5%의 agar를 첨가한 skim milk agar 배지를 제조(Vermelho et al., 1996)하여 사용하였고, cellulase 분비능은 carboxylmethyl cellulose (CMC, JUNSEI chemical Co. Ltd.)을 기질로 선택하여 1% carboxylmethyl cellulose를 함유한 CMC agar 배지를 제조 (Teather and Wood, 1982)하여 사용하였다. 제조된 효소 분비능 측정 배지에 각 균주의 배양 상등액을 0.
- SCJ4의 생장곡선을 확인하기 위해 TSB (Oxoid CM0129) 배지에 접종하여 30℃ shaking incubator, 150 rpm에서 배양하 였고, 4시간 간격으로 흡광도, 건조 균체량과 DPPH를 측정하였다. 생육곡선 측정 결과 4시간에서 28시간까지 대수기를 나타냈고, 24시간 이후 증식이 점차 느려져 28시간부터 정지기에 들어갔다(Fig.
- 배양시간에 따른 생육 정도를 조사하기 위하여 LB 배지에 선별한 균주 5%를 접종하여 30℃ shaking incubator에서 150 rpm, 72시간 배양한 후 건조 균체량, 흡광도, 항산화 활성을 측정하였으며, 시간에 따른 균체 성장의 조사를 위해 4시간 간격으로 배양액을 회수하였다. 건조 균체량의 측정은 배양액 10 ml를 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 멸균 증류수로 3회 세척하여 80℃에서 항량에 도달할 때까지 건조한 후 무게를 측정하였다. 또한 흡광도의 조사를 위하여 배양액 1 ml를 회수하여 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 멸균 증류수로 3회 세척하고, 멸균 증류수 1 ml에 재부유하여 UV/VIS spectrophotometer (SPECORD 200, Analytic jena) 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 항산화 활성은 앞선 방법에 따라 동일하게 측정하였다.
- 최종 선별 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였다. 균주의 동정을 위하여 균체를 Nutrient broth (NB, DifcoTM)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 원심 분리하여 균체를 회수한 뒤ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep kit (Zymo Research Corp.)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 universal primer인 27F와 1492R로 합성하여 유전자 단편을 PCR로 증폭시켰고(Baek et al.
- 배지 구성성분의 선별을 위한 실험 모델의 변수와 수준은 Table 2에 나타내었으며, PBD의 계획법에 따라 11개의 변수를 -1, 0, 1로 부호화하였고, 종속변수로는 건조 균체량(g/L, Y)을 설정하여 실험을 실시하였으며, 3개의 중심점을 포함한 15개의 실험계획으로 이루어진 모델을 실시하였다. 다음으로 선별된 배지성분의 최적 농도를 결정하기 위해 배지성분 각각의 농도 변화가 균체 생산성에 미치는 영향을 중심합성계획법을 이용하여 조사하였다. 배지 조성 성분의 농도 결정을 위한 실험은 Table 3과 같이 앞서 PBD 방법을 통해 선별한 균체량 생산 증가에 중요한 독립변수로 고려되는 인자 즉, tryptone (X1), peptone (X2), MgSO4 (X3)의 농도(g/L)에 대한 중심값과 범위를 설정하여 각각을 -2, -1, 0, 1, 2의 5개의 수준으로 부호화하였다.
- 100 μM DPPH Ethanol용액 1 ml에 200 μl의 배양 상등액을 가한 다음 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 시킨 후 528 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (SPECORD 200, Analytic jena)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다. 대조구로는 배양 배지만을 첨가한 실험구를 사용하여 동일하게 측정하였다.
- 12%를 중요한 인자로 선정하였다. 따라서 앞선 실험 변수의 수준과 균체량에 대한 plot 결과를 토대로 변수의 수준이 증가함에 따라 균체량이 증가하는 요인(positive effects, coefficient with + sign)과 신뢰수준의 결과를 기반으로 하여 tryptone, peptone, MgSO4를 균체 성장을 위한 최적의 factor로 선별하였다.
- 또한 Bergey's manual of systematic bacteriology의 실험법(Leadbetter, 1974)에 기초하여 API 50CH kit (bioMérieux)를 이용해 당발효 특성을 통한 생화학적 특성을 조사하였다.
- 건조 균체량의 측정은 배양액 10 ml를 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 멸균 증류수로 3회 세척하여 80℃에서 항량에 도달할 때까지 건조한 후 무게를 측정하였다. 또한 흡광도의 조사를 위하여 배양액 1 ml를 회수하여 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 멸균 증류수로 3회 세척하고, 멸균 증류수 1 ml에 재부유하여 UV/VIS spectrophotometer (SPECORD 200, Analytic jena) 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 항산화 활성은 앞선 방법에 따라 동일하게 측정하였다.
- ) 프로그램을 사용하였고, 실험계획법은 Plackett-Burman design과 중심합성계획법(CCD, Central composite design)에 따라 설계하였다. 먼저 균체 성장을 위한 최적 배지 조성을 설정하기 위해 11개의 배지 성분 중 균체 성장에 주 효과가 있는 3개의 성분을 선별하기 위해서 다양한 배지 조성 중 주 효과를 주는 요소를 선별할 수 있는 PBD 실험계획법을 사용하였다. 배지 구성성분의 선별을 위한 실험 모델의 변수와 수준은 Table 2에 나타내었으며, PBD의 계획법에 따라 11개의 변수를 -1, 0, 1로 부호화하였고, 종속변수로는 건조 균체량(g/L, Y)을 설정하여 실험을 실시하였으며, 3개의 중심점을 포함한 15개의 실험계획으로 이루어진 모델을 실시하였다.
- subtilis SCJ4의 최적의 균체성장을 위한 배지 조성을 확인하기 위하여 통계학적 방법을 이용하여 배지 최적화를 수행하였다. 먼저 중요한 실험변수를 선별하는 방법으로 실험횟수를 감소시킬 수 있으며 변수들의 영향을 조사할 수 있는 PBD를 이용하여 탄소원 5종(glucose, fructose, molasses, lactose, mannitol), 질소원 3종(yeast extract, tryptone, peptone), 기타 미량원소 3 종(NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4)의 영향을 조사하였다. 실험을 진행하기 위한 high level(+)값과 low level(-)값의 설정은 농도가 높은 탄소원의 경우 중심값에서 10 g/L로 조절하였으며, 질소원은 8 g/L, 기타 미량원소 0.
- 반응표면분석법을 이용하여실시한 최적화 배지에서의 B. subtilis SCJ4의 균체성장을 검증하기 위하여 예측된 최적 균체량 생산배지에 SCJ4를 접종하여 균체의 생산량을 확인하였다. 대조구로는 최적화를 실시하기 이전의 기본 TSB 액체 배지를 사용하였다.
- 배양시간에 따른 생육 정도를 조사하기 위하여 LB 배지에 선별한 균주 5%를 접종하여 30℃ shaking incubator에서 150 rpm, 72시간 배양한 후 건조 균체량, 흡광도, 항산화 활성을 측정하였으며, 시간에 따른 균체 성장의 조사를 위해 4시간 간격으로 배양액을 회수하였다. 건조 균체량의 측정은 배양액 10 ml를 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 멸균 증류수로 3회 세척하여 80℃에서 항량에 도달할 때까지 건조한 후 무게를 측정하였다.
- 먼저 균체 성장을 위한 최적 배지 조성을 설정하기 위해 11개의 배지 성분 중 균체 성장에 주 효과가 있는 3개의 성분을 선별하기 위해서 다양한 배지 조성 중 주 효과를 주는 요소를 선별할 수 있는 PBD 실험계획법을 사용하였다. 배지 구성성분의 선별을 위한 실험 모델의 변수와 수준은 Table 2에 나타내었으며, PBD의 계획법에 따라 11개의 변수를 -1, 0, 1로 부호화하였고, 종속변수로는 건조 균체량(g/L, Y)을 설정하여 실험을 실시하였으며, 3개의 중심점을 포함한 15개의 실험계획으로 이루어진 모델을 실시하였다. 다음으로 선별된 배지성분의 최적 농도를 결정하기 위해 배지성분 각각의 농도 변화가 균체 생산성에 미치는 영향을 중심합성계획법을 이용하여 조사하였다.
- 다음으로 선별된 배지성분의 최적 농도를 결정하기 위해 배지성분 각각의 농도 변화가 균체 생산성에 미치는 영향을 중심합성계획법을 이용하여 조사하였다. 배지 조성 성분의 농도 결정을 위한 실험은 Table 3과 같이 앞서 PBD 방법을 통해 선별한 균체량 생산 증가에 중요한 독립변수로 고려되는 인자 즉, tryptone (X1), peptone (X2), MgSO4 (X3)의 농도(g/L)에 대한 중심값과 범위를 설정하여 각각을 -2, -1, 0, 1, 2의 5개의 수준으로 부호화하였다. 또한, 독립변수의 영향을 받는 종속변수(Y, 균체량)를 측정하여 결과를 회귀분석에 사용하였다.
- 수집한 시료를 멸균 증류수에 현탁하여 단계 희석법을 이용하여 균주를 배양한 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 612종의 미생물을 분리하였다. 분리주를 대상으로 biogenic amine 비생성 균주의 1차 선별을 위하여 biogenic amine 검출용 고체배지를 이용해 정성 실험을 진행하였고, 203종의 분리주가 biogenic amine을 생성하지 않음을 확인하였다(결과 미제시). 1차 선별을 완료한 균주는 LB 액체 배지에 접종하여 2일간 배양한 후 다음 연구에 사용하였다.
- 선별한 분리주에 대한 biogenic amine 생성여부는 정성 및 정량실험을 통해 확인하였다. 정성 실험을 통한 biogenic amine 생성여부의 확인은 biogenic amine 검출용 고체 배지를 제조하여 조사하였다.
- 다양한 기능성 및 생리활성을 갖는 국내 토종 발효미생물을 분리하기 위해 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 메주, 된장, 고추장 시료 약 200여 종을 수집하였다. 수집한 시료를 멸균 증류수에 현탁하여 단계 희석법을 이용하여 균주를 배양한 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 612종의 미생물을 분리하였다. 분리주를 대상으로 biogenic amine 비생성 균주의 1차 선별을 위하여 biogenic amine 검출용 고체배지를 이용해 정성 실험을 진행하였고, 203종의 분리주가 biogenic amine을 생성하지 않음을 확인하였다(결과 미제시).
- 85% NaCl 용액 9 ml에 현탁하여 각 단계별로 희석한 후 희석액 100 μl을 Luria-bertani agar (LB, DifcoTM) 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 순수한 균주를 분리하기 위해 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차적으로 선별한 후 다시 순수 배양하여 균주를 분리하였다. 분리한 미생물은 다음연구에 사용을 위하여 -80℃에서 보관하여 사용하였다.
- 순창군에서 제조된 전통 장류로부터 612종의 다양한 미생물을 분리하였고, 612종의 미생물 중에서 생리활성 분석 및 biogenic amine 생성여부를 조사하여 최종적으로 Bacillus subtilis SCJ4를 선별하였다. 최종 선별한 균주 SCJ4의 생화학 적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 B.
- 식품 유해미생물을 대상으로 선별한 균주의 항균활성을 조사하였다. 식품 유해 미생물은 Micrococcus luteus (KCTC 1056), E.
- 실험계획법은 배지조성을 예측하기 위해 Plackett-Burman design을 사용하여 모델을 설정하였다. 실험 모델을 통하여 선별된 배지 조성으로는 tryptone, peptone, MgSO4로 예측되었으며, 배지조성에 대한 농도를 설정하기 위해 중심합성계획법을 사용하여 최적화를 수행하였다. 최종 예측된 배지 조성의 농도는 tryptone 15.
- 먼저 중요한 실험변수를 선별하는 방법으로 실험횟수를 감소시킬 수 있으며 변수들의 영향을 조사할 수 있는 PBD를 이용하여 탄소원 5종(glucose, fructose, molasses, lactose, mannitol), 질소원 3종(yeast extract, tryptone, peptone), 기타 미량원소 3 종(NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4)의 영향을 조사하였다. 실험을 진행하기 위한 high level(+)값과 low level(-)값의 설정은 농도가 높은 탄소원의 경우 중심값에서 10 g/L로 조절하였으며, 질소원은 8 g/L, 기타 미량원소 0.4 g/L로 변수를 조절하였다 (Table 2). 각각의 실험 변수의 level과 균체량에 대한 plot은 Fig.
- , 2003)와 유사한 경향을 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로 최적 배양 시간을 대수기에서 정지기로 들어가는 24시간으로 설정하였다.
- 선별한 분리주에 대한 biogenic amine 생성여부는 정성 및 정량실험을 통해 확인하였다. 정성 실험을 통한 biogenic amine 생성여부의 확인은 biogenic amine 검출용 고체 배지를 제조하여 조사하였다. Biogenic amine 검출용 고체 배지는 0.
- 제조된 효소 분비능 측정 배지에 각 균주의 배양 상등액을 0.45 μm membrane filter (Sartorius)로 제균한 뒤100 μl씩을 직경 8 mm의 준비한 well에 분주하여 25℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 protease 및 cellulase 분비능을 투명환의 직경으로 조사하였다.
- 최종 선별 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였다. 균주의 동정을 위하여 균체를 Nutrient broth (NB, DifcoTM)에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 원심 분리하여 균체를 회수한 뒤ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep kit (Zymo Research Corp.
- 최종 선별한 SCJ4의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과를 이용하여 BLAST search 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으나, Bacillus 속은 다양한 환경에서 포자를 생성하여 생존할 수 있어 환경에 따라 종 다양성이 매우 큰 세균으로 16S rRNA 염기서열에서 100% 상동성을 나타내더라도 서로 다른 종으로 분류될 수 있기 때문에(Seki et al., 1978) 추가로 API 50CH kit을 사용하여 당 대사능을 분석하였다. 당 대사능 분석 결과는 Table 5와 같으며 glycerol, L-arabinose, D-ribose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, inositol, D-mannitol 등은 발효할 수 있으나 erythritol, D-arabinose, D-xylose, L-xylose 등에는 비 발효성을 나타내며 B.
- 항균력이 있는 9종의 분리주의 항산화 활성 측정은 DPPH에 의한 free radical 제거효과를 측정하여 조사하였다. DPPH는 항산화 활성을 측정하기 위한 대표적인 기질로 페놀성 물질에 대한 항산화 작용의 지표 중 하나이며, free radical에 전자를 공여하여 식품 내 지방질 산화를 억제하고, 인체 내 활성산소에 의한 노화를 억제하여 질병 및 노화를 예방하는데 중요한 역할을 한다(Lee et al.
- 항산화능 및 다양한 효소활성과 항균활성을 갖는 B. subtilis SCJ4의 최적의 균체성장을 위한 배지 조성을 확인하기 위하여 통계학적 방법을 이용하여 배지 최적화를 수행하였다. 먼저 중요한 실험변수를 선별하는 방법으로 실험횟수를 감소시킬 수 있으며 변수들의 영향을 조사할 수 있는 PBD를 이용하여 탄소원 5종(glucose, fructose, molasses, lactose, mannitol), 질소원 3종(yeast extract, tryptone, peptone), 기타 미량원소 3 종(NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4)의 영향을 조사하였다.
대상 데이터
- The experiments were carried out in triplicate (P < 0.05).
- ivanovii (KCTC 3444), Shigella flexneri (KCCM 40948), Shigella sonnei (KCTC 2518), Staphyloccus aureus subsp. aureus (KCCM 41446), Bacillus cereus (KCTC 1661, KCTC 3624) 등 총 13 균주를 대상으로 수행하였다. 유해 미생물의 대한 항균 활성은 유해 미생물이 포함되어있는 0.
- 다양한 기능성 및 생리활성을 갖는 국내 토종 발효미생물을 분리하기 위해 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 메주, 된장, 고추장 시료 약 200여 종을 수집하였다. 수집한 시료를 멸균 증류수에 현탁하여 단계 희석법을 이용하여 균주를 배양한 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 612종의 미생물을 분리하였다.
- subtilis SCJ4의 균체성장을 검증하기 위하여 예측된 최적 균체량 생산배지에 SCJ4를 접종하여 균체의 생산량을 확인하였다. 대조구로는 최적화를 실시하기 이전의 기본 TSB 액체 배지를 사용하였다. 최적 배지에서 배양한 결과 SCJ4의 건조 균체량은 1.
- 메주, 된장, 고추장 시료는 전라북도 순창군 11개 면에서 전통적인 방법으로 제조된 장류 약 200여 종을 수집하였으며, 수집한 시료 1 g을 채취하여 멸균된 0.85% NaCl 용액 9 ml에 현탁하여 각 단계별로 희석한 후 희석액 100 μl을 Luria-bertani agar (LB, DifcoTM) 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다.
- subtilis로 동정되어 16S rRNA sequencing결과와 일치함을 확인하였고, 최종적으로 Bacillus subtilis SCJ4로 명명하였다. 최종 선별 균주인 SCJ4는 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 Bacillus subtilis KCCM 11569P로 기탁하였다.
데이터처리
- 또한, 독립변수의 영향을 받는 종속변수(Y, 균체량)를 측정하여 결과를 회귀분석에 사용하였다. 3회(중심점 3회) 반복 실험하여 평균값을 회귀 분석에 사용하였으며, 이때 3개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 아래와 같다.
- 배지 조성 성분의 농도 결정을 위한 실험은 Table 3과 같이 앞서 PBD 방법을 통해 선별한 균체량 생산 증가에 중요한 독립변수로 고려되는 인자 즉, tryptone (X1), peptone (X2), MgSO4 (X3)의 농도(g/L)에 대한 중심값과 범위를 설정하여 각각을 -2, -1, 0, 1, 2의 5개의 수준으로 부호화하였다. 또한, 독립변수의 영향을 받는 종속변수(Y, 균체량)를 측정하여 결과를 회귀분석에 사용하였다. 3회(중심점 3회) 반복 실험하여 평균값을 회귀 분석에 사용하였으며, 이때 3개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 아래와 같다.
- 중심점 3개를 포함한 모두 17개의 구간에서 실험을 실시하였고, 배양조건을 최적화하기 위하여 3가지 독립 변수들의 조합에 대한 종속변수(건조 균체량)의 반응값을 Table 3에 나타내었다. 반응값에 대한 회귀분석의 모델식 예 측은 Design expert program을 이용하였으며, 분산분석을 수행한 결과 R-square(결정계수)는 0.9175로 1에 가까운 값을 나타내어 높은 유의성을 보였으며, 전체 모델에 대한 유의확률이 0.0048로 0.05보다 작아 가정된 실험 모형이 자료에 적합함을 확인하였다. 또한 변동계수(CV, Coffecient of variation)는 8.
- 여기에서 Y는 종속변수이며, X1, X2, X3은 독립변수, β0은 절편, βX는 회계계수이고, 회귀분석에 의한 모델식의 예측은 Design Expert 9.0 (Version 9.0.3.1, Stat-Ease Inc.)을 이용하여 분석하였고, 회귀분석 결과를 바탕으로 임계점 분석 및 최고 균체 생산을 위한 각 배지 성분의 최적 농도를 결정하였다.
- 순창군에서 제조된 전통 장류로부터 612종의 다양한 미생물을 분리하였고, 612종의 미생물 중에서 생리활성 분석 및 biogenic amine 생성여부를 조사하여 최종적으로 Bacillus subtilis SCJ4를 선별하였다. 최종 선별한 균주 SCJ4의 생화학 적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석에 의해 B. subtilis SCJ4로 명명하였으며, B. subtilis SCJ4의 산업적으로 사용이 적합한 최적배지조성을 확립하기 위하여 통계학적 방법인 반응표면 분석법을 사용하였다. 실험계획법은 배지조성을 예측하기 위해 Plackett-Burman design을 사용하여 모델을 설정하였다.
이론/모형
- 배양 조건의 최적화를 위해 발효공정 및 생산 공정의 최적화를 수행하는데 가장 영향력이 있는 반응표면분석법(Response surface methodology)을 이용하여 통계학적으로 최적화를 수행하였다. 실험계획, 데이터 분석 및 배지의 최적화 분석은 Design Expert 9.
- 분리 미생물이 균체외로 방출하는 세포외 효소들 중 protease, cellulase의 활성 검증을 위하여 well diffusion 방법을 이용하였고, 각 효소와 특이적으로 반응할 기질의 성분이 포함된 고체 선별배지를 사용하였다. Protease 분비능은 skim milk를 기질로 선택하여 2%의 skim milk (DifcoTM)에 1.
- 선별한 균주에 대한 항산화 활성의 측정은 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH, Sigma-aldrich)의 방법(Lee et al., 2009)에 따라 실험하였다. 100 μM DPPH Ethanol용액 1 ml에 200 μl의 배양 상등액을 가한 다음 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 시킨 후 528 nm에서 UV/VIS spectrophotometer (SPECORD 200, Analytic jena)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다.
- 배양 조건의 최적화를 위해 발효공정 및 생산 공정의 최적화를 수행하는데 가장 영향력이 있는 반응표면분석법(Response surface methodology)을 이용하여 통계학적으로 최적화를 수행하였다. 실험계획, 데이터 분석 및 배지의 최적화 분석은 Design Expert 9.0 (Version 9.0.3.1, Stat-Ease Inc.) 프로그램을 사용하였고, 실험계획법은 Plackett-Burman design과 중심합성계획법(CCD, Central composite design)에 따라 설계하였다. 먼저 균체 성장을 위한 최적 배지 조성을 설정하기 위해 11개의 배지 성분 중 균체 성장에 주 효과가 있는 3개의 성분을 선별하기 위해서 다양한 배지 조성 중 주 효과를 주는 요소를 선별할 수 있는 PBD 실험계획법을 사용하였다.
- subtilis SCJ4의 산업적으로 사용이 적합한 최적배지조성을 확립하기 위하여 통계학적 방법인 반응표면 분석법을 사용하였다. 실험계획법은 배지조성을 예측하기 위해 Plackett-Burman design을 사용하여 모델을 설정하였다. 실험 모델을 통하여 선별된 배지 조성으로는 tryptone, peptone, MgSO4로 예측되었으며, 배지조성에 대한 농도를 설정하기 위해 중심합성계획법을 사용하여 최적화를 수행하였다.
- 유해 미생물의 대한 항균 활성은 유해 미생물이 포함되어있는 0.8% soft agar plate를 이용한 well diffusion 법(Park et al., 2002)에 준하여 조사하였으며, 0.45 μm membrane filter (Sartorius)로 제균한 분리 균주의 배양 상등액 100 μl을 각 항균활성 측정 배지의 well에 분주하고 30℃ incubator에서 24시간 동안 배양하여 억제환의 크기에 따라 항균활성을 측정하였다.
- 최종 선별된 배지성분의 최적 농도를 결정하기 위해 배지 성분 각각의 농도 변화가 B. subtilis SCJ4의 균체 성장에 미치는 영향을 반응표면분석법 가운데 중심합성계획법을 이용하여 분석하였다. 중심점 3개를 포함한 모두 17개의 구간에서 실험을 실시하였고, 배양조건을 최적화하기 위하여 3가지 독립 변수들의 조합에 대한 종속변수(건조 균체량)의 반응값을 Table 3에 나타내었다.
성능/효과
- subsp. (KCTC 3444), M. luteus (KCTC 1056), B. cereus (KCTC 1661, KCTC 3624)와 그람 음성세균인 S. typhimurium (KCTC 1926) 등 7종의 유해 미생물에 대한 우수한 항균활성을 나타내었다 (Table 4). 특히 SCJ4는 L.
- 8767 g/L의 건조 균체량으로 가장 높은 세포성장을 보였다. 24시간에서 28시간 이내에 B. subtilis의 세포 성장이 정지기에 도달한다는 보고(Yang and Chang, 2007; Chi et al., 2011)와 일치하는 결과를 보였으며, 항산화능의 경우 생육 초기에 증가하여 24시간 이후 급속히 감소하는 경향을 보였다. 이는 Bacillus sp.
- , 2003). DPPH를 이용하여 분리주의 항산화 활성을 측정한 결과 선별 균주 중 SCJ3, SCJ34, SCJ287, SCJ305가 10% 이상의 DPPH 활성을 나타냈으며, SCJ4는 7.5865%의 항산화 활성을 갖고 있어 4개의 균주와 비교하여 낮은 수치를 나타냈다. 하지만 앞선 조사를 통해 밝혀진 다른 활성능에서는 가장 우수한 결과를 보였고, 미생물에 의한 항산화 활성의 경우 배지의 조성 및 배양 조건에 따라 항산화 활성의 차이를 나타낸다고 보고(Kim and Heo, 2005)되어 SCJ4 균주를 포함한 5개의 균주를 선별하였다.
- cereus KCTC 1661의 경우 40–50% 활성능이 증가하였다. DPPH에 의한 항산화능 또한 7.5865%에서 23.1586%로 3배 증가하여 균체의 성장 은 높은 증가를 나타내지 않았지만 SCJ4 균주가 갖는 활성은 증가하는 효과를 얻을 수 있었다. 추후 SCJ4의 산업화 및 다양한 분야에 응용을 위해서는 안전성 및 산업화를 위한 최적화 공정이 필요하지만, 다양한 분야에 응용이 가능한 B.
- 4 g/L로 변수를 조절하였다 (Table 2). 각각의 실험 변수의 level과 균체량에 대한 plot은 Fig. 2와 같으며, tryptone, peptone, NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4는 높은 수준에서 균체량이 증가하는 경향을 보였고, 나머지 변수는 높은 수준으로 갈수록 균체량이 감소하는 것으로 분석 되었다. 반응값에 대한 각 변수의 영향, 모델 계수, F-value, P-value와 신뢰수준에 대한 분석결과는 실험결과에 의한 통계처리를 통하여 Table 6에 나타내었다.
- 결과와 일치함을 확인하였고, 최종적으로 Bacillus subtilis SCJ4로 명명하였다. 최종 선별 균주인 SCJ4는 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 Bacillus subtilis KCCM 11569P로 기탁하였다.
- 균체 성장을 위한 최적의 결과값을 얻기 위해 신뢰수준이 90% 이상으로 나타난 glucose 94.41%, fructose 91.67%, tryptone 98.73%, peptone 92.07%, MgSO4 99.12%를 중요한 인자로 선정하였다.
- , 1978) 추가로 API 50CH kit을 사용하여 당 대사능을 분석하였다. 당 대사능 분석 결과는 Table 5와 같으며 glycerol, L-arabinose, D-ribose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, inositol, D-mannitol 등은 발효할 수 있으나 erythritol, D-arabinose, D-xylose, L-xylose 등에는 비 발효성을 나타내며 B. subtilis로 동정되어 16S rRNA sequencing결과와 일치함을 확인하였고, 최종적으로 Bacillus subtilis SCJ4로 명명하였다. 최종 선별 균주인 SCJ4는 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 Bacillus subtilis KCCM 11569P로 기탁하였다.
- , 2004). 따라서 1차 선별한 203종의 분리주를 대상으로 well diffusion 방법을 통해 protease 및 cellulase 생성능을 조사하였고, 86종의 분리주가 protease 및 cellulase 2가지 효소를 모두 생성하면서 활성능 또한 우수한 것을 확인하였다(Table 4).
- 따라서 중 심합성계획법을 이용하여 실시한 실험모델의 예측값이 신뢰 할 수 있음을 확인하였고, 최적화를 실시하기 이전인 대조구의 균체량 0.8767±0.008819 g/L과 비교하면 28% 증가한 0.2455 g/L의 균체량이 향상되었다(Fig. 4).
- 1). 또한 28시간에 흡광도 1.3848 (OD600)와 0.8767 g/L의 건조 균체량으로 가장 높은 세포성장을 보였다. 24시간에서 28시간 이내에 B.
- 05보다 작아 가정된 실험 모형이 자료에 적합함을 확인하였다. 또한 변동계수(CV, Coffecient of variation)는 8.22로 상대적으로 낮은 수치를 나타내어 균체량 생산에 변수들의 독립적인 영향 뿐만 아니라 변수들 간의 상호작용도 매우 높음을 확인하였다(Table 7). 균체량에 대한 반응표면 회귀 방정식은 아래와 같다.
- 4). 또한 최적화 배지에서 배양한 결과 세포외 효소활성은 배지 조성에 영향 없이 동일한 활성능을 보였고, 항균활성의 경우 선별과정에서 활성을 보인 7개의 균주 중 S. typhimurium KCTC 1926, M. luteus KCTC 1056, B. cereus KCTC 3624은 모두 동일한 활성을 보였고, L. monocytogenes KCCM 40307, L. monocytogenes KCTC 3710, L. ivanovii subsp. ivanovii KCTC 3444, B.
- 5 g/L로 예측되었다. 이때 최대 균체량은 1.07497 g/L로 예측되었으며, 모델의 검증실험을 통하여 예측된 모델과 실제 결과가 동일함을 확인하였으며, 기본배양배지와 비교하였을 때 균체량이 0.8767 g/L에서 1.1222 g/L으로 약 28% 증가하였다.
- 특히 SCJ4, SCJ34, SCJ123, SCJ305, SCJ520, SCJ587의 분리주에서는 histamine, tyramine이 모두 검출되지 않아 앞서 진행한 biogenic amine 검출용 고체배지를 이용해 진행한 정성분석과 결과와 동일한 것을 확인하였다. 이상의 결과를 바탕으로 세포외 효소활성과 항균 및 항산화 활성, biogenic amine 생성확인 모두에서 우수한 결과를 나타낸 SCJ4를 최종 균주로 선정하였다.
- subtilis SCJ4의 균체 성장에 가장 영향을 주는 독립변수의 농도를 예측할 수 있었으며, 실험 범위내에서 tryptone과 MgSO4는 첨가량이 증가할수록 균체량이 증가한 반면, peptone 의 경우 첨가량에 따라 큰변화를 나타내지 않았다. 중심합성계획법을 통해 최대 균체량은 1.07497 g/L로 예측되었고, 이 때의 각 변수의 농도는 tryptone 15.35 g/L, peptone 12.235 g/L, MgSO4 3.5 g/L이었다.
- 최적 배지에서 배양한 결과 SCJ4의 건조 균체량은 1.1222±0.008819 g/L로 중심합성계획법으로 실시하여 예측된 1.07497 g/L와 큰 차이를 보이지 않았다.
- 실험 모델을 통하여 선별된 배지 조성으로는 tryptone, peptone, MgSO4로 예측되었으며, 배지조성에 대한 농도를 설정하기 위해 중심합성계획법을 사용하여 최적화를 수행하였다. 최종 예측된 배지 조성의 농도는 tryptone 15.35 g/L, peptone 12.235 g/L, MgSO4 3.5 g/L로 예측되었다. 이때 최대 균체량은 1.
- 3에 나타내었다. 최종적으로 반응표면분석을 통해 B. subtilis SCJ4의 균체 성장에 가장 영향을 주는 독립변수의 농도를 예측할 수 있었으며, 실험 범위내에서 tryptone과 MgSO4는 첨가량이 증가할수록 균체량이 증가한 반면, peptone 의 경우 첨가량에 따라 큰변화를 나타내지 않았다. 중심합성계획법을 통해 최대 균체량은 1.
- SCJ3, SCJ287, SCJ555의 일부 분리주에서 biogenic amine이 검출되었으나 정량이 되지 않는 검출수치를 나타내었고, 식품 내 histamine은 8–40 mg은 약한 정도, 40–80 mg은 중증 정도, 100 mg 이상은 극심한 중독 증상을 일으킬 수 있고, tyramine은 100 mg 이상을 섭취해야 중독증상을 일으킬 수 있다고 보고하고 있어(Maijala and Eerola, 1993) 앞서 선별한 균주 모두 유해한 수준은 아님을 확인하였다. 특히 SCJ4, SCJ34, SCJ123, SCJ305, SCJ520, SCJ587의 분리주에서는 histamine, tyramine이 모두 검출되지 않아 앞서 진행한 biogenic amine 검출용 고체배지를 이용해 진행한 정성분석과 결과와 동일한 것을 확인하였다. 이상의 결과를 바탕으로 세포외 효소활성과 항균 및 항산화 활성, biogenic amine 생성확인 모두에서 우수한 결과를 나타낸 SCJ4를 최종 균주로 선정하였다.
- , 2007) 등 식품 유해 미생물에 대한 다양한 효과가 보고되고 있다. 활성 조사 결과 선별 분리주 대부분은 1개 이상의 유해 미생물에 대한 항균활성을 갖고 있었고, SCJ3, SCJ4, SCJ34, SCJ123, SCJ287, SCJ305, SCJ520, SCJ555, SCJ587 등 9종이 다양한 유해미생물에 항균활성을 갖고 있었으며 활성능 또한 우수하였다. 분리주 중 SCJ4은 그람 양성세균인 L.
후속연구
- monocytogenes와 같은 저온성 병원 미생물의 성장 억제에도 효과적일 것으로 예상되며, 세포외 효소활성이 우수하고 항균물질 생산성이 높은 균주를 선발하여 발효에 이용할 경우 생리활성이나 저장성이 증진된 장류의 개발이 가능할 것이다. 또한 전통 장류 발효에 다양한 항유해균 스펙트럼을 갖는 균주의 사용은 HACCP 시스템의 도입이 어려운 장류 업체 및 소규모 제조업체에서는 오염문제를 해결하는 효과적인 대안이 될 것이며, 장류 발효 이외에도 동물 사료, 의료, 공중 위생분야에서 사용 가능성을 고려해 볼 수 있을 것이다.
- 1586%로 3배 증가하여 균체의 성장 은 높은 증가를 나타내지 않았지만 SCJ4 균주가 갖는 활성은 증가하는 효과를 얻을 수 있었다. 추후 SCJ4의 산업화 및 다양한 분야에 응용을 위해서는 안전성 및 산업화를 위한 최적화 공정이 필요하지만, 다양한 분야에 응용이 가능한 B. subtilis로의 가능성을 확인하였다.
- typhimurium (KCTC 1926) 등 7종의 유해 미생물에 대한 우수한 항균활성을 나타내었다 (Table 4). 특히 SCJ4는 L. monocytogenes와 같은 저온성 병원 미생물의 성장 억제에도 효과적일 것으로 예상되며, 세포외 효소활성이 우수하고 항균물질 생산성이 높은 균주를 선발하여 발효에 이용할 경우 생리활성이나 저장성이 증진된 장류의 개발이 가능할 것이다. 또한 전통 장류 발효에 다양한 항유해균 스펙트럼을 갖는 균주의 사용은 HACCP 시스템의 도입이 어려운 장류 업체 및 소규모 제조업체에서는 오염문제를 해결하는 효과적인 대안이 될 것이며, 장류 발효 이외에도 동물 사료, 의료, 공중 위생분야에서 사용 가능성을 고려해 볼 수 있을 것이다.
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