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문제 정의
- Catechin의 UV-induced apoptosis의 보호효과가 인정되었지만 한편으로는 UV가 cell proliferation을 일으킨다는 보고가 있기 때문에 본 연구에서는 cell proliferation 관련DNA 합성의 변화를 관찰하였다. 본 연구에서는 UVB에 의해 손상된 세포가 세포증식이 일어나는지 또한 catechin을 처리하였을 때 어떠한 영향을 미치는지 알아보기위해immunohistochemical 염색법을 이용한 BrdU# 측정하였다.
- 있기 때문에 본 연구에서는 cell proliferation 관련DNA 합성의 변화를 관찰하였다. 본 연구에서는 UVB에 의해 손상된 세포가 세포증식이 일어나는지 또한 catechin을 처리하였을 때 어떠한 영향을 미치는지 알아보기위해immunohistochemical 염색법을 이용한 BrdU# 측정하였다. BrdU는 세포의 DNA 합성 검색법으로 세포주기(cell cycle) 중 S기 (S phase)만 표지되어 세포증식의 지표로 많이 사용되고 있다.
- 본 연구에서는 in vivo hairless mouse skin에서 catechin이 UNB에 의해서 손상된 피부조직에 미치는 영향 및 손상된 피부세포증식과 apoptosis에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 세척된 membrane에 1차 항체, Anti-human p53 (Pharmingen, USA)을 2시산정노 반응시킨후 2차 항체를 반응시켰다. 그리 고 ECL solution (Amersham Pharmcia Biotech., Buckinghamshire, England)에 1 분간 반응시킨 후hyperfilm에 노출시켜 단백질 발현을 관찰하였다";
- Catechin 투여군은 마우스 등측 피부에 체중당 3mg/mouse로 1일 1회 도포하여 2주간 투여하였으며 UV 조사군은 UVB=100 mJ/cm2의 조사량으로 solarimeter (Dong Sung Labtech Co., Korea)를 이용하여 1일 1 회 2주간 조사하였다. Catechin과 자외선 병용투여군은 catechin을 마우스 등 측 피부에 도포한 다음 자외선을 조사하였고, 대조군은acetone을 catechir과 동량인 0.
- , Korea)를 이용하여 1일 1 회 2주간 조사하였다. Catechin과 자외선 병용투여군은 catechin을 마우스 등 측 피부에 도포한 다음 자외선을 조사하였고, 대조군은acetone을 catechir과 동량인 0.1 ml을 등측- 피부에 도포하였다.
- Catechin과 자외선 병용투여시의 피부에 미치는 영향을 알아보기 위하여 hairless mice를 각 군당 8마리씩 4군을 두어 실험하였다. Catechin 투여군은 마우스 등측 피부에 체중당 3mg/mouse로 1일 1회 도포하여 2주간 투여하였으며 UV 조사군은 UVB=100 mJ/cm2의 조사량으로 solarimeter (Dong Sung Labtech Co.
- Hairless mouse를 부검하기 1시간 전에 BrdU를 복강 투여하였다. 파라핀에 포매된 조직을 45um의 두께로 박절하여 슬라이드 글래스에 접착시킨 다음 에탄올로 탈수하였다.
- Horse-radish peroxidase (Boehringer Mannheim, Germany) 용액을 조직에 처리하여 37℃에서 30분간 반응시키고 PBS로 3회 세척하였다. Substrate solution (DAB; 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride)을 가해 10분간 실온에서 반응시켜 PBS로 3회 세척한 후 핵이 갈색으로 염색된 것을 apoptotic cell로 확인하고 microscope (Olympus., Japan) 상에서 200배의 배율로 관찰하여 세포 100개당 염색된 apoptotic cells의 개수를 세었다.
- 각군의 마우스 등피부조직 0.1 g을 채취하여 균질화(homo genization) 시킨 우 phenol/chlorofbrm extract방법에 의해서 추출한 sample에 RNase A를 처리하여 DNA를 추출하고 2 % agrose gel에서 각각 1 ug/ul씩 넣어 80 Vblt에서 1시간 동안 전기영동하였다20).
- 100 mJ/cn?로 2주간 매일 처리하였다. 사람이 실외에서 작업시 UV 노출량이나 여름에 해수욕시 노출량은 하루에 50〜 100 mJ/cirF이라는 보고가 있다2? Fig.
- 자외선에 의한 피부손상의 정도를 관찰하기 위해 hairless mouse를 대조군과 3개의 실험군 즉 catechin군, 자외선군, 자외선과 catechin을 처리한 군으로 나누어 catechin을 3 mg/mouse 농도로 2주간 국소 도포하였다. 자외선 조사량은 UV3를 100 mJ/cn?로 2주간 매일 처리하였다.
- 조직 병리학적으로 관찰하기 위하여 2주간 실험을 마친 후 부검하여 마우스의 등피부조직을 일정한 크기로 절제하여 10% 중성완충포르말린 용액에서 고정하여 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포41하여 4~5um 두께로 조직표본을 만든 다음 H&E 염색하여 현미경으로 관찰하였다.
- 이어 Avidin-Biotin complex를 30분간 반응시킨 후 세척하여, DAB (3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride)> 기질로 사용하였다. 증류수로 세척하고 hematoxylin으로 대조염색을 실시하였다.
대상 데이터
- Guanidine HC1, Ethylene diamine tetraacetic acid, Disodium salt, Dihydrate, Tween 20, Triton X-100, RNase, Proteinase K, Ethidium bromide, Agarose, Sodium Acetate, Phenol: Chloroform: Iso- amlyalcohol (25:24:1), Isoprophenol등은 Sigma사 제품을 사용하였다. Anti-BrdU (Beckman, USA), Anti-human p53 는 Pharmingen (San Diego, USA)에서 구입하여 사용하였고, Anti-mouse IgG는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Hyperfilm (Kodak MR film)은 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) 에서 구입하였고 기타 시약은 주로 Sigma Chem.
- 1에 나타내었다. Guanidine HC1, Ethylene diamine tetraacetic acid, Disodium salt, Dihydrate, Tween 20, Triton X-100, RNase, Proteinase K, Ethidium bromide, Agarose, Sodium Acetate, Phenol: Chloroform: Iso- amlyalcohol (25:24:1), Isoprophenol등은 Sigma사 제품을 사용하였다. Anti-BrdU (Beckman, USA), Anti-human p53 는 Pharmingen (San Diego, USA)에서 구입하여 사용하였고, Anti-mouse IgG는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz,CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Catechin은 MITSUI NORIN Co. LTD (Shizuoka, Japan)제품을 사용하였고, 본 실험에서 사용한 catechin의 조성과 구조를 Table 1과 Fig. 1에 나타내었다. Guanidine HC1, Ethylene diamine tetraacetic acid, Disodium salt, Dihydrate, Tween 20, Triton X-100, RNase, Proteinase K, Ethidium bromide, Agarose, Sodium Acetate, Phenol: Chloroform: Iso- amlyalcohol (25:24:1), Isoprophenol등은 Sigma사 제품을 사용하였다.
- 단기피부 손상실험을 하기위해 8주령의 수컷 SKH-1 hairless 마우스를 식품의약품안전청 국립독성연구소 실험동물자원 실로부터 구입하였고, 1주일의 적웅 기간을 거쳐 실험하였다.
데이터처리
- 시험결과치는 Sigmastat 프로그램(Version 2.03, Jandal Scientific Co.)을 이용하여 one-way ANOVA 검정을 실시한 후 multiple comparison test (Student-Newman-Keuls Method)를 실시하여 pv0.05인 것을 유의성있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- TUNEL assay는 In Situ Cell Death Detection Kit (Boeh ringer Mannheim, Germany)를 이용하였다21). 피부조직 슬라이드를 Xylene처리하여 파라핀을 제거한 후 ethanol로 탈수하였다.
- 따라서 catechin이 UVB에 의해 손상된 DNA에대한 보호효과가 있는 것으로 생각된다. 자외선에 의해 손상된 피부조직에서의 p53 변화를 살펴보기 위해 catechin이 자외선에 의한 보호효과를 Western blot에 의해서 해석하였다. p53은 tumor suppressor gene으로서 UV에 의해 변이되어지는 가장 대표적인 유전자로서 UV에 노출되었을 때 p53의 합성이 증가하여 cell cycle에서 Gl-S transition단계를 조절한다고 알려져 있기 때문이다.
성능/효과
- 4B). UVB를 2주간 조사한 피부는 진피층이 교원섬유의 증가에 의하여 정상피부보다 2~3배 비후되었고, 섬유화 세포가 관찰되었다. 표피층은 두꺼워졌으나 상피세포가 소실되어 1~2층으로 되었고, 상피세포는 핵이 농축되고 호산성의 세포질로 이루어져 UVB 조사에 의해 손상되어 있음을 알 수 있었다(Fig.
- 따라서 UV에 대한 catechin 의 보호효과가 p53에서도 영향이 있는지 관찰하기 위해 2주간 처리한 후 부검하여 조직을 얻어 단백질을 추출하여 western blot을 실시하였다. UV에 의해 p53 단백질의 발현을 조사한 결과 control에 비해 2.18배 현저하게 p53의 발현이 불활성화 되었다. 그러나 UV+catechin군에서는 p53의 발현이 UV을 조사한 군의 결과와 비슷하게 2.
- BrdU는 세포의 DNA 합성 검색법으로 세포주기(cell cycle) 중 S기 (S phase)만 표지되어 세포증식의 지표로 많이 사용되고 있다. 그 결과 BrdU LI (Labelling Index)는 대조군이 3.2 + 0.7(n=5), catechin 군은 5.3 ± 2.1(n=5)으로 유의한 차이는 없었다. UVB군은 25.
- 3은 2주간 처리 후 조직을 부검하기전 찍은 사진이다. 대조군과 catechin군은 육안으로 보았을 때 별차이가 없었으며 자외선을 조사한군에서는 catechin을 도포해주었을 때 sun bum, sun tan, erythema등 손상이 적음을 확인할 수 있었다. 아무것도 처리하지 않은 대조군의 hairless mouse 피부는 다른 동물과 유사하게 2~3층의 표피상피와 불규칙하게 배열된 교원섬유, 피지선, 모낭과 hairless mouse에서 특징적으로 나타나는 각화된 낭(keratinized cyst)이 관찰되었다(Fig.
- 8). 따라서 이 연구에서는 UVB의 영향으로 cell proliferation0] 발생하고, UVB와 catechin을 처리하였을 때 감소하는 경향이 나타남을 알 수 있었다. Ouhtil은 UVB 가죽은 세포들을 대체하기 위해 피부에서 hyperplasia가 유발하며 apoptosis와 세포증식 과정은 밀접하게 연관되어 있어조절되어지고 만성 UVB 조사시에는 이러한 apoptosis와 세포증식의 관계가 조화의 불균형으로 피부암을 일으킬 수 있다고 보고하였다29).
- Tea polyphenol은 발암의 다양한 단계에서 세포의 생존과 세포증식을 억제할 수 있다고 보고되었다 30). 본 연구 결과에 의하면 catechin이 UWB에 의한 피부의 손상과 apoptosis* 억제하고 세포증식을 유의하게 감소시켰다(p<0.05). 본 연구에서는 정상세포인 hairless mouse의 피부세포를 이용하여 UVB로 인해 손상된 세포에 catechin 을 처리하였을 때 apoptosis# 억제하였고, 손상된 세포증식도 감소시킴이 밝혀졌다.
- 05). 본 연구에서는 정상세포인 hairless mouse의 피부세포를 이용하여 UVB로 인해 손상된 세포에 catechin 을 처리하였을 때 apoptosis# 억제하였고, 손상된 세포증식도 감소시킴이 밝혀졌다. 따라서 UVB에 의해 유도된 세포증식 억제 및 세포사 억제능력이 catechin의 항암작용의 일부 작용기전으로 생각된다.
- 자외선으로 인한 발암성은 중요한 유전자의 변이와 면역반응의 억제등 DNA 손상으로 일어난다 23). 본 연구에서도 피부세포에서 DNA를 추출하여 2% agarose gel에서 전기연동하여 본 결과 UVB를 처리한 군에서는 DNA ladder가 관찰되었으나 UVB와 catechin을 처리한 군에서는 관찰되지 않아 catechin이 DNA 손상을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다(Fig. 5). 이와는 달리 Xiaohua Tan의 연구에서는 대장암세포인 LoVo cell에 catechin 의 주요성분인 EGCG, EGC, ECG, EC를 각각 처리하였을 때 EGCG와 EGC에서 강한 DNA ladder가 생성되어 apoptosis를 유도한다고 하였다.
- 4D). 이 결과 catechin의 세포재생 능력을 증명하여 주었고 UVB에 대한 보호 효과를 알 수 있었다.
- UVB를 2주간 조사한 피부는 진피층이 교원섬유의 증가에 의하여 정상피부보다 2~3배 비후되었고, 섬유화 세포가 관찰되었다. 표피층은 두꺼워졌으나 상피세포가 소실되어 1~2층으로 되었고, 상피세포는 핵이 농축되고 호산성의 세포질로 이루어져 UVB 조사에 의해 손상되어 있음을 알 수 있었다(Fig. 4C). UVB 조사와 catechin을 2주간 처리한 후의 mouse의 피부는 표피층이 9~12층으로 이루어져 있었고, 세포의 핵은 과염색성을 보이며 커져있어 손상된 표피층 상피세포가 재생되고 있었다(Fig.
후속연구
- 7). 이 결과는 catechin이 UV에 의해 손상된 DNA를 복구하는 DNA polymerase 같은 enzyme0] 미쳐활성화되지 못한 것에 기인되는 것으로 생각되며 앞으로catechin의 DNA repair enzyme 활성화 연구가 추후에 필요하다고 생각된다.
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