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문제 정의
- 본 연구에서는 견 피브로인을 STMP로 인산화하고 그에 따른 특성 평가를 통하여 기능성 식품소재로써의 응용 가능성을 검토하였다.
- 인산화 반응 결과로 인은 특정부위에 결합하게 되는데 이 결합 위치의 분석방법에는 (i) 인 결합의 pH 안정성에 의한 O-P, N-P의 구분, (ii) 반응기(수산기, 타이로실, 아미 노, 이미다졸, 구아디노, 카르복실과 술포히드릴기 뿐만 아니라 펩티드 결합)의 손실 분석, (ⅲ) 아미노산의 분석, 그리고 (ⅳ) 31P NMR spectroscopy가 있다(Matheis and Whitaker, 1984). 본 연구에서는 견 피브로인의 인산화 반응 위치를 규명하기 위해 FT-IR분석과 31P NMR spectroscopy를 행하였다.
제안 방법
- 31P NMR 분석은 H3PO4(85%)을 external standard로 하고, 시료는 각각 0.05 g 견 피브로인/I ml D2O, 0.05 g 인산화된 견 피브로인/I ml DQ로 하여 pH 8.0로 조정하여 Table 2와 같은 조건으로 측정하였다(Matheis et al., 1983).
- STMP로 견 피브로인을 인산화 시키는 반응에서, 처리 조건별로 실험하여 적정 조건을 구하였고, 인이 결합되는 위치를 규명하기 위해 FT-IR과 31P NMR 분석을 행했고, 인산화된 견 피브로인의 특성을 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 견 피브로인 수용액을 적정 처리 pH, 온도, 시간으로 고정하고 STMP의 농도를 50, 100, 150 및 200%(o.w.f)로 하여 각각 인산화 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리-냉동건조하는 방법으로 분말을 제조하였다.
- 먼저, 적정 pH를 구하기 위해 처리 온도(35℃, 처리 시간(2 hr), STMP 농도(100% o.w.f)를 고정시킨 후, 적정 pH 를 구했으며, 온도, 시간, STMP 농도 순으로 적정 조건을 설정하였다
- f)로 하여 각각 인산화 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 원심분리-냉동건조하는 방법으로 분말을 제조하였다. 각 sample 의 I.
- 5에서 가장 많이 생성되었고, 처리 온도가 25℃에서는 LAL이 조금씩 생성되기 시작하여 85℃일 때 최고치에 이르고, 처리시간은 10분부터 생성되어 처리 시간이 길수록 많이 생성된다고 보고하였다. 본 실험에서는 단백질의 알칼리 처리와 고온 및 장시간 처리시 생성되는 LAL을 최소화하는 조건과 인산화 정도를 함께 고려하여 적정처리 pH를 12로 하였다.
- 용해도는 탁도 측정에 사용된 1% 용액을 원심분리 (20,000 rpm, 20분)한 후 10배 희석하여 자외선 영역의 최대 흡수파장인 276 nm에서 UV-Vis spectrophotometere- 측정하여 흡광도를 용해도의 척도로 하였다.
- 이상으로 견 피브로인을 인산화 반응 조건별로 실험을 행하여 적정 조건을 구하였으며 기기분석을 통하여 견 피브로인 중의 특정 아미노산과 인의 결합 부위 및 형태에 대해 고찰하였고, 인산화에 따른 제 물성의 변화를 비교 검토하였다
- 1 N NaOH 용액으로 pH를 일정하게 유지시켰다. 인산화 반응의 적정 조건을 구하기 위하여 pH(9.5, 10.5, 11.5, 12.5), 처리 온도(25, 35, 45℃), 처리 시간(0.5, 1, 2, 3, 4 hr)과 STMP 농도(50, 100, 150, 200 o.w.f(on the weight of fibroin))의 4가지 조건별로 실험을 행하였다.
- 인산화된 견 피브로인의 탁도는 1% 견 피브로인 용액(w/v)을 사용하여 UV-Vis spectrophotometer(DU-650, Beckman)로 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 절각견을 고압염색기(제작)에서 1시간 동안 i3(rc에서 정련한 후 깨끗이 세척하고 풍건시켜 준비한 정련 견사 를 40% LiBr 용액(100℃에서 3시간 용해시킨 후(匕條 舒正，1980) cellulose membrane(dialysis tubing, M.W.= 12,000)으로 실온에서 흐르는 물에 4일간 투석을 하였다. 그 다음 glass filter(G-3)로 여과한 후, 원심분리기 (L8- 55M, Beckman)에 의해 20,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하고 상등액을 취하여 glass filter(G-4)로 다시 여과 하여 얻은 견 피브로인 수용액을 48시간 동결 건조하여 분말화하였다
- 95. 조절하여 pyrophosphate와 zinc ion이 결합된 zinc pyrophosphate 침전물을 얻었다.
데이터처리
- , 1972). 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 그 평균값을 취하였다.
이론/모형
- FT-IR 분석은 KBr-pellet 방법으로 4,000-500 cm-1 범위에서 BoMEM (Aride-Zone) FT-IR로 즉정하였다.
- STMP(M.W=306)는 Bell(1950)의 방법에 따라 NaH2PO4 를 electric furnace로 530℃에서 5시간 가열한 후, 미세한 분말로 만들어 다시 같은 조건에서 2시간 동안 추가로 가 열하였다(Pass and Sutcliffe, 1968).
성능/효과
- 1. 견 피브로인을 STMP로 인산화 시킬 때, 알칼리도가 클수록, 처리 온도가 높을수록 인산화 정도가 증가되었다.
- 2. 처리시간에 따른 인산화 정도는 1 hr까지는 급격하게 증가하였고, Ihr 이후에는 서서히 증가되어 비교적 단시간에 인산화가 많이 진행되었다.
- 3. STMP 농도에 따른 인산화 정도는 50%까지는 급격히 증가되지만, 100% 이상에서는 증가가 미약하였다.
- 4. 인산화된 견 피브로인의 FT-IR 분석에서, 각 시료는 a-helix에 가까운 형태이었고, 아미노기에 의한 인산화 반응(phosphoramidation)은 고려되지 않았다.
- 5. 31P NMR 분석 결과에서는 인산화가 polyphosphate 형태로 되어 있다는것을 알 수 있었다.
- Fig. 15는 각 시료의 유화력과 유화안정성을 나타낸 것으로 시료 P100(인산화가 63% 됨.)이 유화력이 가장 좋았으며, 그 이상에서는 약간 감소하는 경향이었고, 유화 안정성은 인산화가 많이 될수록 계속적으로 유화력이 증가되었다.
- Fig. 7은 처리 pH, 온도 및 시간을 각각 고정하고, STMP 농도(o.w.f)에 따른 인산화 정도를 나타낸 그림으로써 전반적으로 STMP 농도가 증가할수록 인산화 정도도 증가되었고, STMP 농도 50%까지는 인산화가 급격히 이루어졌지만, 그 이상의 농도에서는 인산화의 증가 정도가 미약한 것으로 나타났다.
- 견 피브로인의 유화력은 최고 18%, 유화안정성은 21%가 증가되었다.
- 이상의 FT-IR spectra 결과에서 인산화는 R-O-P, <])-O-P 두 가지 형태 모두 가능하고, 아미노기에서는 반응이 일어나지 않지만 N-P 형태도 가능하다고 보여진다.
- (Matheis and Whitaker, 1984). 인산화된 견 피브로인은 무처리 시료에 비하여 거품성은 1.6배, 거품안정성은 2배가 증가되었다
- 한편, NP 시료의 spectra에서는 나타나지 않았던 특징적인 peak가 인산화가 진행됨에 따라 1,100 cmT와 772 cm-1에서 출현함을 확인할 수 있었다.
- 한편, amide Ⅲ band의 peak는 NP 시료가 1,242 cm-1에서 나타나는 것에 비해 인산화가 진행될수록 왼쪽으로 약간 shift되어 P200의 경우에는 1,246 에서 peak가 나타났고, 또한 NP에서는 나타나지 않았던 shouldei도 점점 뚜렷하게 나타났다.
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