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문제 정의
- 합환피성분의 약리작용에 관한 연구로는 saponin fraction에서 자궁수축작용 증가를 보고한 것, 24)polysaccharide fraction이 sarcoma 180 solid form에 대하여 항암 활성을 보고한 것, 25)항균활성에 관한 것, 26)설사를 억제시키는 효과에 관한 것, 師 꽃에서 추출된 flavonol glycoside들에 의한 수면효과를 보고한 것28)들이 있으나, 혈액암인 백혈병에 대한 항암 활성 연구는 아직 보고된 바가 없다. 그러므로 본 연구는 합환피의 물 추출물을 이용하여 급성 림프성 백혈병 세포주인 Jurkat T lymphocytes에 대한 apoptosis 유도효과가 있는지를 조사하였다.
- Apoptosis 관련 유전자로 잘 알려진 p53는 세포고사가 진행되는 세포들에서 단백질 발현량이 증가하는 것으로 밝혀졌고, 증가된 p53 단백질이 Bcl-2의 단백질 발현량을 억제시키고 Bax의 단백질 발현량을 증가시키는 것으로 알려져 왔다.34) 본 실험은 wild type-p53가 결핍된 Jurkat 세포에서 Bcl-2 및 Bax가 세포고사와 관련성이 있는지를 알아보고자 하였다. 합환피를 처리하여 세포고사를 유도한 Jurkat 세포에서 Bcl-2 및 Bax의 단백질 발현 정도를 Western blot으로 조사하였다.
- 우리나라의 산야에는 약용 및 식용으로 이용할 수 있는 식물이 많이 자생하고 있고, 이들 중에는 항암 효능을 가진 식물이 상당히 많이 있을 것으로 사료되므로 과학적인 실험을 통하여 천연물질의 항암효능을 검증하여야 할 것이다. 본 연구는 콩과에 속하는 낙엽교목인 자귀나무의 수피를 건조한 합환피11)를 이용하여 백혈병 세포주인 Jurkat에 대한 항암효능을 검증하고자 하였다. MTT assay와 Trypan blue 용액으로 세포 생존율 변화를 측정한 결과, 합환피는 농도 의존별로 Jurkat 세포의 생존율을 점점 감소시켰다(Fig.
제안 방법
- 부유성인 Jurkat 세포의 배양액은 L-glutamine이 포함된 RPMI 1640 배지에 56℃ 수조에서 30분간 가온하여 불활성화시킨 fetal bovine serum (FBS)을 10% 포함하고, 1% 항생제(100 units/m/ penicillin, 100 阐 ml streptomycin)와 배지 1 L당 NaHC03 2 g을 첨가하여 제조하였다.
- 세포들은 plastic culture dish에서 배양되었고, 4X 105 cells/m/ 정도의 세포 수를 가진 배양 배지에 합환피 추출물을 투여하였다. Jurkat 세포들은 여러가지 농도(5, 10, 20, 30, 40 μg/mZ)의 추출물로 24시간 동안 처리되었다.
- 합환피 분말은 4℃에 저장되었고 사용 직전에 40 mg/ml 농도로 만든 후 실험에 필요한 농도로 배양배지에 희석하여 사용하였다. 세포고시는 아래에 기재된 것처럼 세포 성장률의 비교, 세포 핵 내 염색체 형태의 변화 및 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) 단백질의 가수분해 패턴 등을 비교하여 결정하였다.
- 세포 증식에 대한 합환피 성분의 영향을 알아보기 위하여 Jurkat 세포를 24-well plate에 배양한 후 합환피의 추출물을 5, 10, 20, 30, 40 gg/mZ 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그 후 각 표본들의 세포를 1.
- 5 m/ tube에 모았으며, 동일 용량의 trypan blue 용액을 tube에 첨가한 후 부드럽게 섞고 3분간 방치하였다. 살아있는 세포의 수는 혈구 측정기로 계수하였다. MTT assay는 생존한 암세포들의 효소활성을 측정하는 것으로 세포를 96-well plate에 배양한 후 합환피 추출물을 위의 실험과 동일한 조건으로 처리하였다.
- 각 well에 5 mg/ml 농도로 저장된 MTT 용액 20 W를 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액이 포함된 배양액을 제거하고 각 well 당 0.1% isopropanol 150 |丑를 첨가하여 30분간 더 배양 후 microplate reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 3회의 서로 다른 실험 결과를 종합하여 평균 값과 표준편차 값을 그림으로 나타내었다.
- 5%(v/v) tween-20을 포함한 Tris-NaCl-lween 20 (TNT) buffer를 이용하여 만들어진 5%(w/v) nonfet milk 용액에 넣어서 선처리 하였다. Nonfet milk 용액에 1 gg/m/농도로 만들어져 있는 PARR CPP32, Bcl-2 및 Bax 일차 항체를 1시간 동안 실온에서 membrane에 처리하였다. Membrane들을 TNT buffer에 의해 10분 간격으로 S회 세척하였고, 일차 항체에 알맞은 이차 항체 (peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin과 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
- Membrane들을 TNT buffer에 의해 10분 간격으로 S회 세척하였고, 일차 항체에 알맞은 이차 항체 (peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin과 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다시 membrane들을 TNT buffer로 세척한 후 enhanced chemiluminescence reagent (Amersham)을 이용하여 2분간 반응시킨 후, X-ray필름을 이용하여 반응의 강도를 확인하였다.
- 세포를 PBS 용액으로 세척한 후 원심분리기를 이용하여 순수 세포만을 모았다. DNAzol reagent 1 m2을 넣고 pipetting하여 세포 pellet을 분쇄하였다.
- 3분 후 DNA pellet만 남기고 상등액을 제거하고 DNA precipitate를 95% 에탄올 에 2회 세척하고 5~15분 정도 실온에서 air dry 시켰다. DNA를 Tns-EDTA buffer를 이용하여 녹인 후 분광광도계를 이용하여 260 nm와 280 nm의 optical density (OD) 값을 측정하여 DNA를 정량 호였다. 10 用의 DNA 표본들을 10 ng/m/ 농도의 ethidium bromide를 포함한 1.
- 진통, 구충제로 널리 사용되어 왔다.(2) 본 실험에서는 사람의 급성림프성백혈병 세포주인 Jurkat의 세포사멸에 대한 합환피 추출액의 효과를 알아보기 위하여 추출액을 5, 10, 20, 30 및 40eg/m/ 농도로 증가시키면서 세포 배양배지에 처리하여 24시간 동안 세포를 배양하였다. Fig.
- 합환피에 노출된 Jurkat의 세포사멸이 수동적이고 물리적인 necrosis인지, 능동적이고 자발적인 생리적 사멸의 apoptosis인지를 확인하기 위하여 Fig. 1과 동일한 조건하에서 처리된 표본들을 이용하여 DNA fragmentation 실험을 실시하였다. 정상세포와 세포사멸이 유도된 세포들로부터 완전한 염색체 DNA가 아닌 분절이 일어난 DNA를 추출하여 전기영동을 실시하였다.
- 1과 동일한 조건하에서 처리된 표본들을 이용하여 DNA fragmentation 실험을 실시하였다. 정상세포와 세포사멸이 유도된 세포들로부터 완전한 염색체 DNA가 아닌 분절이 일어난 DNA를 추출하여 전기영동을 실시하였다. 그 결과 Fig.
- 것으로 알려져 있다.30, 3D 특히, caspase-3(CPP32) 는 효소학적으로 세포고사를 일으키는데 결정적인 역할을 수행하므로, 합환피의 여러 농도에 24시간 노출되어 세포고사가 일어난 Jurkat 세포의 경우에도 caspase-3의 활성도가 변하는지를 조사하였다. 그 결과 대조군에서는 pro-caspase-3의 형태인 32 kDa의 크기가 검출되었으며, 세포고사가 일어나는 세프들에서는 caspase-3의 활성화된 형태인 17kDa 크기의 분자량을 볼 수가 있었다(Fig.
- 현재까지 알려진 기질들을 보면 poly (ADP-ribose) polymerase (RkRP), RB, actin, lamin, fcxlrin, PKA, presenilin 등 다양하다.32, 紹)그러므로 caspase-3의 주요 기질로 알려진 R4RP 단백질 분해 양상을 조사하기 위하여 Jurkat 세포 배양배지에 합환피를 Fig. 3과 같이 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 결과 5 J提/mZ의 저농도에서 116 kDa의 완전한 PARP 단백질이 85 kDa 크기로 분해되는 양상이 유도되었으며, 처리 농도가 높으면 높을수록 PARP 단백질 가수분해 정도가 증가함을 알 수 있었다(Fig.
- DNA를 Tns-EDTA buffer를 이용하여 녹인 후 분광광도계를 이용하여 260 nm와 280 nm의 optical density (OD) 값을 측정하여 DNA를 정량 호였다. 10 用의 DNA 표본들을 10 ng/m/ 농도의 ethidium bromide를 포함한 1.0%(w/v) agarose gel로 2시간 정도 전기영동을 하였고 ultraviolet light 에서 DNA 절편들을 관찰하였다.
대상 데이터
- 사람 T 세포성 유래의 급성림프성백혈병 세포주인 Jurkate 미국세포주 은행인 The American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 분양 받아, 실험실에서 37℃, 5% CO2 공급조건을 갖춘 Sanyo회사 배양기에서 배양하였다. 부유성인 Jurkat 세포의 배양액은 L-glutamine이 포함된 RPMI 1640 배지에 56℃ 수조에서 30분간 가온하여 불활성화시킨 fetal bovine serum (FBS)을 10% 포함하고, 1% 항생제(100 units/m/ penicillin, 100 阐 ml streptomycin)와 배지 1 L당 NaHC03 2 g을 첨가하여 제조하였다.
- Monoclonal anti-B\RP 항체는 Calbiochem (San Diego, CA, USA) 회사로부터 구입하였고, monoclonal anti-CPP32, monoclonal anti-Bax 항체들과 polyclonal anti-Bcl-2 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 회사로부터 구입하였다. Peroxidaselabeled sheep anti-mouse immunoglobulin와 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin은 Amersham Life Sciences (Cleveland, OH, USA)회사로부터 구입하였다.
- Peroxidaselabeled sheep anti-mouse immunoglobulin와 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin은 Amersham Life Sciences (Cleveland, OH, USA)회사로부터 구입하였다.
이론/모형
- Lysates를 13, 000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 상등액만을 취하여 다른 tube에 옮겼다. 단백질 농도는 Bradford 빙법 (BioRad) 어〕 준흐忡 측정하였으며, 표준 단백질로 bovin serum albumin (BSA)를 사용하였다. 각 실험군 마다 동일 양의 단백질이 7.
- 34) 본 실험은 wild type-p53가 결핍된 Jurkat 세포에서 Bcl-2 및 Bax가 세포고사와 관련성이 있는지를 알아보고자 하였다. 합환피를 처리하여 세포고사를 유도한 Jurkat 세포에서 Bcl-2 및 Bax의 단백질 발현 정도를 Western blot으로 조사하였다. 그 결과 대조군의 Bcl-2 및 Bax 단백질 발현정도와 여러가지 농도의 합환피를 처리한 실험군 모두에서 Bcl-2 및 Bax 단백질 발현 정도를 비교해 볼 때 차이점을 발견할 수 없었다 (Fig.
성능/효과
- p data-page="1">암이란 개체를 구성하는 세포가 정상적인 조직 기능의 범주와 주위 장기의 정상적인 영향력에서 벗어나 몸에 불리하게 과잉 성장하는 것을 의미한다.1) 현재 암은 국내 및 서구 사회에서 심혈관질환 다음으로 일반적인 사망 원인으로 부각되었으며, 1998년 세계 보건기구 자료에 의하면 선진국의 암 사망자 수가 전체사망 원인의 21%를 차지하였다. 또한 암은 아직도 그 발생 원인과 기전이 명백히 밝혀져 있지 않은 상태이며 생물학적 성상이 복잡하기 때문에 난치병으로 인식되고 있어, 21세기 인간수명의 연장을 위해 최우선적으로 극복되어야 할 과제 중의 하나로 사료된다.
- 1A에서 보여지듯이, trypan blue 용액으로 세포 생존율 변화를 측정한 결과, 합환피는 처리농도 의존별로 Jurkat 세포의 생존율을 급격히 감소시키면서 세포사멸을 증가시켰다. MTT assay 결과 또한 대조군에 비교하여 5 ng/ml 농도로 처리한 실험군에서 38%의 세포사멸이 일어났음을 보여주었고, 10, 20, 30 및 40)ig/m/ 농도로 처리한 그룹들에서도 각각 55, 73, 78 및 83%의 세포사멸이 일어났음을 보여주었다(Fig. IB). 합환피에 노출된 세포들의 외부형태적인 특징을 현미경 하에서 관찰한 결과 세포막 외부 융기의 돌출현상을 볼 수 있었다 (data not shown).
- 정상세포와 세포사멸이 유도된 세포들로부터 완전한 염색체 DNA가 아닌 분절이 일어난 DNA를 추출하여 전기영동을 실시하였다. 그 결과 Fig. 2에서 보여주듯이, 합환피 추출액을 10 μ奶의 저농도로 처리한 실험군에서도 고분자량의 DNA(50~300 kb)와 oligonucleosome 크기의 DNA 분절(180 bp)을 포함하는 apoptotic DNA ladder 현상을 agarose gel에서 볼 수 있었다. DNA 분절의 정도는 투여된 합환피의 농도가 높을수록 점차 증가함을 알 수 있었다(Fig.
- 2에서 보여주듯이, 합환피 추출액을 10 μ奶의 저농도로 처리한 실험군에서도 고분자량의 DNA(50~300 kb)와 oligonucleosome 크기의 DNA 분절(180 bp)을 포함하는 apoptotic DNA ladder 현상을 agarose gel에서 볼 수 있었다. DNA 분절의 정도는 투여된 합환피의 농도가 높을수록 점차 증가함을 알 수 있었다(Fig. 2). 이와 같은 DNA 분절 양상은 기존의 연구보고29)에 의해 밝혀진 결과와 마찬가지로 세포고사가 진행되는 세포에서 internucleosomal DNA cleavage가 초래되어 나타나는 DNA 크기와 일치함을 보여주므로 합환피에 의한 Jurkat의 세포사멸은 programed cell death 임을 보여준다.
- 30, 3D 특히, caspase-3(CPP32) 는 효소학적으로 세포고사를 일으키는데 결정적인 역할을 수행하므로, 합환피의 여러 농도에 24시간 노출되어 세포고사가 일어난 Jurkat 세포의 경우에도 caspase-3의 활성도가 변하는지를 조사하였다. 그 결과 대조군에서는 pro-caspase-3의 형태인 32 kDa의 크기가 검출되었으며, 세포고사가 일어나는 세프들에서는 caspase-3의 활성화된 형태인 17kDa 크기의 분자량을 볼 수가 있었다(Fig. 3A). 이러한 현상은 합환피의 처리 농도가 높을수록 더욱 증가함을 알 수 있었다 (Fig.
- 3과 같이 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 결과 5 J提/mZ의 저농도에서 116 kDa의 완전한 PARP 단백질이 85 kDa 크기로 분해되는 양상이 유도되었으며, 처리 농도가 높으면 높을수록 PARP 단백질 가수분해 정도가 증가함을 알 수 있었다(Fig. 3B). 이러한 실험 결과는 핵 속에서 일어나는 DNA fragmentatione 경향과 매우 잘 일치함을 보여 주었다.
- 3B). 이러한 실험 결과는 핵 속에서 일어나는 DNA fragmentatione 경향과 매우 잘 일치함을 보여 주었다. 이런 관점에서 볼 때 합환피 처리에 의한 PARP 단백질의 쪼개짐 현상은 caspase-3 활성의 가장 주요한 증거 중의 하나이며 세포고사의 현상이 일어남을 보여준다.
- 합환피를 처리하여 세포고사를 유도한 Jurkat 세포에서 Bcl-2 및 Bax의 단백질 발현 정도를 Western blot으로 조사하였다. 그 결과 대조군의 Bcl-2 및 Bax 단백질 발현정도와 여러가지 농도의 합환피를 처리한 실험군 모두에서 Bcl-2 및 Bax 단백질 발현 정도를 비교해 볼 때 차이점을 발견할 수 없었다 (Fig. 4A, B). 이는 합환피 처리에 의한 Jurkat의 세포고사는 Bcl-2 및 Bax와 관련없이 다른 신호기 전에 의해서 진행되는 것으로 추정된다.
- 본 연구는 콩과에 속하는 낙엽교목인 자귀나무의 수피를 건조한 합환피11)를 이용하여 백혈병 세포주인 Jurkat에 대한 항암효능을 검증하고자 하였다. MTT assay와 Trypan blue 용액으로 세포 생존율 변화를 측정한 결과, 합환피는 농도 의존별로 Jurkat 세포의 생존율을 점점 감소시켰다(Fig. 1). 또한 합환피에 노출된 세포들의 외부 형태적인 특징을 현미경 하에서 관찰한 결과 세포막 외부 융기의 돌출현상과 사멸 소체를 배지 속에서 볼 수 있었다.
- 1). 또한 합환피에 노출된 세포들의 외부 형태적인 특징을 현미경 하에서 관찰한 결과 세포막 외부 융기의 돌출현상과 사멸 소체를 배지 속에서 볼 수 있었다. 이들 결과는 합환피의 추출성분이 Jurkat 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 유도하는 효과가 있음을 보여준다.
- 또한 합환피에 노출된 세포들의 외부 형태적인 특징을 현미경 하에서 관찰한 결과 세포막 외부 융기의 돌출현상과 사멸 소체를 배지 속에서 볼 수 있었다. 이들 결과는 합환피의 추출성분이 Jurkat 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 유도하는 효과가 있음을 보여준다.
- 4°)그 중에서도 caspase-3라는 효소는 불활성화한 zymogen(N-terminal prodomain, p20 large subunit, plO small subunit) 상태로 존재하다가 세포사멸의 신호를 받아 활성화된 형태로 되며, 이 효소와 관련된 기질 단백질들로는 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), retinoblastoma, fodrin, lamins, gelsolin 등이 알려져 있다.‘孔33)본 연구에서 caspase-3의 주요 기질로 알려진 PARP 분해패턴을 조사하기 위하여 Jurkat 세포 배양배지에 합환피를 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양한 결과 116 kDa의 완전한 PARP 단백질이 85 kDa 크기로 분해되는 양상이 유도되었으며, 처리 농도가 높으면 높을수록 PARP 분해 정도가 증가함을 알 수 있었다(Fig. 3). 합환피 처리에 의한 PARP 단백질의 쪼개짐 현상은 caspase-3 활성의 가장 주요한 증거 중의 하나이며 이를 통하여 세포고사의 현상이 일어남을 보여준다.
후속연구
- 이런 관점에서 볼 때 합환피 처리에 의한 PARP 단백질의 쪼개짐 현상은 caspase-3 활성의 가장 주요한 증거 중의 하나이며 세포고사의 현상이 일어남을 보여준다. 합환피에 의해 유도된 세포고사의 경우 어떤 기질 단백질들이 가장 중요한 역할을 하는지는 차후 조사해 보아야 할 것이다.
- 할 것이다. 우리나라의 산야에는 약용 및 식용으로 이용할 수 있는 식물이 많이 자생하고 있고, 이들 중에는 항암 효능을 가진 식물이 상당히 많이 있을 것으로 사료되므로 과학적인 실험을 통하여 천연물질의 항암효능을 검증하여야 할 것이다. 본 연구는 콩과에 속하는 낙엽교목인 자귀나무의 수피를 건조한 합환피11)를 이용하여 백혈병 세포주인 Jurkat에 대한 항암효능을 검증하고자 하였다.
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