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문제 정의
- 본 연구에서는 염증반응, 암세포를 비롯한 면역세포에 다양한 기능을 나타내는 zerumbone이 T세포 이동에 대해서는 어떠한 영향을 미치는가를 알아보았다. 이를 위해 케모카인의 일종인 SDF-1α를 이용하여 사람 T세포주인 Jurkat 세포의 이동을 유도하였고, zerumbone이 SDF-1α유발 Jurkat 세포의 이동을 감소시키는 현상을 관찰할 수 있었다.
- 본 연구는 zerumbone이 T세포의 기능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 진행되었다. 실험은 T세포 연구에 주로 사용되는Jurkat 세포주(clone E6-1)로 진행하였다.
- 본 연구를 통해 T세포의 증식과 이동에 대해 zerumbone이 나타내는 효과를 간략하게 살펴 보았다. 향후에는 보다 더 많은 추가연구가 요구된다.
제안 방법
- 이를 위해 케모카인의 일종인 SDF-1α를 이용하여 사람 T세포주인 Jurkat 세포의 이동을 유도하였고, zerumbone이 SDF-1α유발 Jurkat 세포의 이동을 감소시키는 현상을 관찰할 수 있었다.
- 세포 이동 평가를 위해 8 μm pore size의 falcon cell culture inserts (Corning Co., NY, USA)와 24 wells 짜리 falcon companion tissue culture plate (Corning Co., NY, USA)를 사용하였다.
- 37°C, 5% CO2 조건에서 10시간 배양 후, Ez-CYTOX 시약 10 μL을 각 well에 첨가하였다.
- 배양은 37°C, 5% CO2 조건을 맞춘 배양기를 이용하여 진행하였다.
- 40152)는 한국세포주은행으로부터 분양 받았다. 세포배양액은 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium with L-glutamine(Lonza, Walkersvill, MD, USA)에 10%(v/v) Fetal bovine serum(FBS) (Gibco, Co., Grand Island, NY, USA), 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (Gibco, Co., Grand Island, NY, USA),1%(v/v) 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES) (Welgene Inc., Daegu, Korea), 1% (v/v) non-essential amino acid (Welgene Inc., Daegu, Korea)를 첨가하여 사용하였다. 배양은 37°C, 5% CO2 조건을 맞춘 배양기를 이용하여 진행하였다.
- 세포증식 측정은 WST assay kit인 EZ-CYTOX (Daeillab service,Co., Seoul, Korea)를 이용하여 시행하였다. 업체에서 제공한 사용법을 일부 변경하여 진행하였다.
- 조건당 2×105개의 Jurkat 세포를 다른 농도의 SDF-1α (0, 100 ng/mL, 200 ng/mL)로 처리하여, 4 h, 10 h, 18 h 동안 배양한 후underwell로 이동한 세포의 개수를 구하였다(Fig. 2).
- SDF-1α에 의해 유도된 Jurkat 세포 이동에 zerumbone이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 transwell을 이용하여 실험을 진행하였다.
- 준비된 insert를 각 underwell에 삽입하고 37°C, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 후에 insert를 제거하고 underwell로 이동한 세포들을 trypan-blue를 이용하여 염색계수 하였다.
- 조건당 2×105개의 Jurkat 세포를 다른 농도의 SDF-1α(0, 100 ng/mL, 200 ng/mL)으로 자극하며 10 h을 배양하되, 두개의 그룹으로 나누어 한 그룹은 zerumbone 100 nM을 넣어주고 배양을 진행하였고, 다른 그룹은 zerumbone 없이 배양을 진행하였다.
- 이러한 결과로 미루어 100 ng/mL, 200 ng/mL의 SDF-1α를 10시간 동안 처리하는 조건이 가장 적절한 이동을 유발하는 것으로 판단되어, zerumbone 효과의 평가를 위해서 100ng/mL, 200 ng/mL의 SDF-1α를 사용하여 10시간 배양을 하기로 결정하였다.
- 다음으로 zerumbone이 T세포의 이동에 미치는 영향을 알아보기에 앞서, 본 연구에 맞는 적절한 SDF-1α의 처리농도와 배양시간을 결정하기 위하여 두가지 농도의 SDF-1α와 함께 4, 10, 18 h 동안 세포를 배양하며 T세포 이동 정도를 측정하였다.
- 조건당 2×105개의 Jurkat 세포를 다른 농도의 SDF-1α(0, 100 ng/mL, 200 ng/mL)으로 자극하며 10 h을 배양하되, 두개의 그룹으로 나누어 한 그룹은 zerumbone 100 nM을 넣어주고 배양을 진행하였고, 다른 그룹은 zerumbone 없이 배양을 진행하였다. 배양 후 underwell로 이동한 Jurkat 세포들을 trypan-blue를 이용하여 염색계수 하였다. SDF-1α로 자극하지 않은 basal level의 이동은 zerumbone에 의해 영향을 받지 않은 것으로 관찰되었다.
- 실험은 T세포 연구에 주로 사용되는Jurkat 세포주(clone E6-1)로 진행하였다. 우선적으로 T세포의 기본 증식에 대한 zerumbone의 영향을 살펴보았다. WST assay를 통해 살펴본 결과, zerumbone은 기본적인 Jurkat 세포의 활성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
- 실험은 migration buffer (RPMI 1640, 10 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA)를 이용하여 진행하였고, 실험 전 세포는 migration buffer와 함께 37°C, 5% CO2 환경에서 2시간 동안 starvation 과정을 거쳤다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 시약은 Zerumbone (Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, MO, USA)와 Stromal cell-derived factor-1α (SDF-1α)(R&D Systems Co., Minneapolis, USA)이었다.
- Jurkat 세포주(clone E6-1; JE6-1, KCLB No. 40152)는 한국세포주은행으로부터 분양 받았다. 세포배양액은 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium with L-glutamine(Lonza, Walkersvill, MD, USA)에 10%(v/v) Fetal bovine serum(FBS) (Gibco, Co.
- 본 연구는 zerumbone이 T세포의 기능에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 진행되었다. 실험은 T세포 연구에 주로 사용되는Jurkat 세포주(clone E6-1)로 진행하였다. 우선적으로 T세포의 기본 증식에 대한 zerumbone의 영향을 살펴보았다.
데이터처리
- 로 표현하였다. ANOVA를 이용한 Student t-test를 통해 p＜0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Cells were stimulated with various concentrations of SDF-1α (0, 100, 200 ng/mL). After various times of incubation, the cells having migrated to the underwells were counted through typan bleu exlusion counting method. The blank graph is the results of 4 h incubation, the grey is of 10h, and the black is 18h.
- Cells were stimulated with 100 ng/mL and 200 ng/mL of SDF-1αwith or without zerumbone (100 nM). After 10h of incubation, the cells having migrated to the underwell were counted through trypan blue exclusion counting method. Values present mean±SDof three separate experiments (*p＜0.
성능/효과
- 이를 위해 케모카인의 일종인 SDF-1α를 이용하여 사람 T세포주인 Jurkat 세포의 이동을 유도하였고, zerumbone이 SDF-1α유발 Jurkat 세포의 이동을 감소시키는 현상을 관찰할 수 있었다. 반면에 water soluble tetrazolium (WST) 을 이용한 cell viability 측정을 통해 zerumbone이 Jurkat 세포의 증식에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 본 연구를 통해, 간단하지만 분명하게 확인된 zerumbon의 기능은 추후에 보다 생리적인 세포(사람 말초혈액 T세포 혹은 실험용 쥐의 T세포)를 대상으로 확인되어야 할 것이며, 세포학적ㆍ생화학적 기전에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 앞서 결정한 조건에 100 nM의 zerumbone을 추가하여 이동 실험을 진행한 결과, SDF-1α를 처리하지 않았을 경우zerumbone은 Jurkat 세포의 이동에 거의 영향을 주지 않았으나,다른 농도(100 ng/mL, 200 ng/mL)의 SDF-1α를 처리했을 경우에는 zerumbone에 의해 25%, 17%의 이동 감소가 각각 발생하였다.
- 100 ng/mL의 SDF-1α를 처리하며 4시간을 배양했을 경우에 2.3배의 이동 증가가 발생한 반면, 10시간을 배양했을 경우에는 약 4.1배의 이동 증가가 발생했음을 확인하였다.
- 우선적으로 T세포의 기본 증식에 대한 zerumbone의 영향을 살펴보았다. WST assay를 통해 살펴본 결과, zerumbone은 기본적인 Jurkat 세포의 활성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 1 nM에서 1000 nM (1 μM)까지 다양한 농도로 zerumbone 처리를 해주었으나, zerumbone을처리하지 않은 대조군과 비교하여 분명한 변화를 보이는 경우는 없었다.
- 그러므로, TCR/CD28로 유도되는 특이 T세포 증식에 대한 zerumobone의 영향을 알아보기 위해서는 생리적 T세포를 통한 확인이 요구된다. 이와는 별도로, 첫번째 결과를 통해 본 연구에 사용된zerumbone의 양(100 nM)이 세포독성을 나타내지 않는다는 사실도 확인할 수 있었다. zerumbone의 사용량을 결정하는 것은 중요한 의미를 갖는다.
- 본 연구에서는 zerumbone이 SDF-1α로 유도된 T림프구 세포주 Jurkat세포의 이동을 감소시키는 것을 transwell system을 이용하여 확인하였다; 100 ng/mL의 SDF-1α로 유발시킨 이동은 약 25%, 200ng/mL의 SDF-1α로 유발시킨 경우에는 약 17%의 감소를 나타냈다.
- 본 연구에서는 zerumbone이 SDF-1α로 유도된 T림프구 세포주 Jurkat세포의 이동을 감소시키는 것을 transwell system을 이용하여 확인하였다; 100 ng/mL의 SDF-1α로 유발시킨 이동은 약 25%, 200ng/mL의 SDF-1α로 유발시킨 경우에는 약 17%의 감소를 나타냈다. 반면에, Jurkat 세포의 기본 증식에는 큰 변화를 유발하지 않는다는 점을 WST assay를 통해 확인하였다. 이는 zerumbone이 지닌 새로운 기능이지만, 향후 생리적 세포를 통해 다시 확인해야 하며, zerumbone에 의한 세포자멸사 유발, CXCR4 발현 감소 등 세포학적 기전 연구와 ZAP-70, Erk1/2의 인산화 변화 측정 등 생화학적 기전 연구가 필요하다.
후속연구
- 림프구의 움직임을 조절하는 분자들에 대한 많은 연구가 진행 중인데, 대표적인 분자들로 케모카인(chemokine)과 케모카인 수용체(chemokine-receptor), 접촉분자로통칭되는 셀렉틴(selectin), 어드레신(addressin), 인테그린(integrin)등이 있다(Bordon, 2011). 이렇듯 복잡하게 조절되는 면역세포 이동현상의 정확한 조절 기작에 대한 많은 연구가 진행되고 있으며, 이를 통해 다양한 면역질환과 종양의 발병 및 진행에 대한 깊이 있는 이해가 가능할 것으로 기대하고 있다. 더욱이, 면역세포 이동현상 조절 기작에 대한 이해를 바탕으로 인위적 이동현상 조절을 통한 질환 치료에 대한 실마리를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- 이렇듯 복잡하게 조절되는 면역세포 이동현상의 정확한 조절 기작에 대한 많은 연구가 진행되고 있으며, 이를 통해 다양한 면역질환과 종양의 발병 및 진행에 대한 깊이 있는 이해가 가능할 것으로 기대하고 있다. 더욱이, 면역세포 이동현상 조절 기작에 대한 이해를 바탕으로 인위적 이동현상 조절을 통한 질환 치료에 대한 실마리를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.
- 반면에 water soluble tetrazolium (WST) 을 이용한 cell viability 측정을 통해 zerumbone이 Jurkat 세포의 증식에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 본 연구를 통해, 간단하지만 분명하게 확인된 zerumbon의 기능은 추후에 보다 생리적인 세포(사람 말초혈액 T세포 혹은 실험용 쥐의 T세포)를 대상으로 확인되어야 할 것이며, 세포학적ㆍ생화학적 기전에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 1 nM에서 1000 nM (1 μM)까지 다양한 농도로 zerumbone 처리를 해주었으나, zerumbone을처리하지 않은 대조군과 비교하여 분명한 변화를 보이는 경우는 없었다. 그렇지만, 100 nM 부터 대조군에 비해 미세한 증식 증가의 경향을 보이는 것으로 미루어, zerumbone의 처리 농도를 높여 동일한 실험을 시행할 필요성은 있을 것으로 사료된다. 또한 생리적인 T세포를 이용하여 zerumbone의 증식에 대한 효과를 확인하는 것이 필요하다 여겨진다.
- 본 연구를 통해 T세포의 증식과 이동에 대해 zerumbone이 나타내는 효과를 간략하게 살펴 보았다. 향후에는 보다 더 많은 추가연구가 요구된다. 특히 zerumbone의 이동 감소 효과 기전에 대한 연구가 우선적으로 필요하며, 이를 위해 먼저 시행할 수 있는 것은,SDF-1α의 수용체인 CXCR4의 발현이 zerumbone에 의해 변화되는지 여부를 확인하는 것이다.
- 아울러,SDF-1α에 의해 유발되는 신호전달 체계가 zerumbone에 의해 어떻게 변화되는지 여부도 확인해야 한다.
- Sung 등(2008)은 zerumbone이 유방암 세포주와 췌장암 세포주의 CXCR4 발현을 감소시켜 SDF-1α에 의해 유도되는 종양세포 침입 현상을 막는다는 보고를 하였다. 또한, zerumbone이 백혈병 세포 내에서 G2/M 세포주기 집중, 미토콘드리아 경로와 Fas 경로를 통한 세포자멸사를 유발한다는 보고가 있으므로(Xian 등, 2007), 본 연구에서 사용된 세포배양 조건하에서도 zerumbone에 의해 세포자멸사가 유도되는지 여부를 확인할 필요가 있다. 이를 통해 zerumbone의 작용이 실제로 세포의 이동을 감소시킨 것인지, 세포의 죽음을 유도함으로써 underwell의 세포수가 감소한 것인지를 구별할 수 있을 것이다.
- 또한, zerumbone이 백혈병 세포 내에서 G2/M 세포주기 집중, 미토콘드리아 경로와 Fas 경로를 통한 세포자멸사를 유발한다는 보고가 있으므로(Xian 등, 2007), 본 연구에서 사용된 세포배양 조건하에서도 zerumbone에 의해 세포자멸사가 유도되는지 여부를 확인할 필요가 있다. 이를 통해 zerumbone의 작용이 실제로 세포의 이동을 감소시킨 것인지, 세포의 죽음을 유도함으로써 underwell의 세포수가 감소한 것인지를 구별할 수 있을 것이다. 아울러,SDF-1α에 의해 유발되는 신호전달 체계가 zerumbone에 의해 어떻게 변화되는지 여부도 확인해야 한다.
- SDF-1α에 의해 T세포 내에서 발생하는 주요 신호전달 현상은 ZAP-70과 Erk1/2의 인산화 증가이다(Alampour-Rajabi 등, 2015; Ticchioni 등, 2002). 이 두 분자의 인산화가 zerumbone에 의해 어떻게 변화하는지 확인하는 것은 본 연구에서 확인한 zerumbone의 이동 감소 효능의 생화학적 기전을 설명하는 중요한 시발점이 될 수 있을 것이다.
- 반면에, Jurkat 세포의 기본 증식에는 큰 변화를 유발하지 않는다는 점을 WST assay를 통해 확인하였다. 이는 zerumbone이 지닌 새로운 기능이지만, 향후 생리적 세포를 통해 다시 확인해야 하며, zerumbone에 의한 세포자멸사 유발, CXCR4 발현 감소 등 세포학적 기전 연구와 ZAP-70, Erk1/2의 인산화 변화 측정 등 생화학적 기전 연구가 필요하다.
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