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문제 정의
- '6)알레르기 유발성 평가를 위해서는 자국민에게 알레르기를 유발하는 식품 및 특정 성분에 대한 모니터링 및 database 구축, 혈청은행 (serum bank) 설립을 위한 작업이 활발히 진행 중인 상황이다. 특히 식품 알레르기에 관한 연구는 각 나라 마다 고유의 식이 문화에 따라 그 지역에서의 특정식 품에 대한 알레르기에 따라 주된 관심분야가 달라지는 경우가 대부분 이며,'" 인종간 또는 개인간에도 큰 차이를 나타내므로, 나름대로 자체적인 연구가 필요한 분 야라 할 수 있겠다. 따라서 본 연구에서는 일차적으로 국내에서 여러가지 가공식품으로 소비도가 높은 유전 자재조합 콩(Roundup Ready"4)을 대상으로 crude extract, 열처리, 열 및 인공위액을 처리한 후, SDSmGE 및 콩 알레르기 환자의 혈액을 이용한 immunoblot, ELISA를 실시하여, 재래 콩과 비교 평가함 으로서, 유전자재조합에 따른 알레르겐의 양적인 변화 등 그 알레르기 유발성을 비교 , 평가하고자 하였다.
- 식품 알레르기는 일반적으로는 두 드러기, 홍반, 설사(Gluten-sensitive enteropathy or celiac disease), 구토 등을 나타내나, 아나필락시스 쇼 크를 유발이 심한 경우에는 생명을 위협하기도 하므 로, 중요하게 고려되어야 할 안전성 평가 항목으로 주 목받고 있다. 특히, 콩은 두부, 두유, 발효식품 등으로 폭넓게 사용되어 국내에서 소비가 많은 식품으로 본 연구에서 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase [EPSPS] 단백질이 삽입됨으로써 제초제 내성 (glyphosate tolerant)을 나타내는")유전자재조합 콩(Roundup Ready™)의 알레르기 유발 가능성을 재래 콩과 비교하여 기존의 알레르기 유발성의 변화를 평가하고자, 임 상시험결과(skin prick test, open food challenge test) 콩에 알레르기 반응을 나타낸 환자의 혈청을 이용하여 ELISA, SDS-RkGE 및 immunoblot을 실시하였다. 한편, 열 및 인공위액을 처리에 따른 알레르기 유발성분의 물리화학적 특성을 평가하여 알레르겐의 열에 대한 안정성과 소화액에 대한 저항성을 비교 평 가하였다.
제안 방법
- 05% Tween 20)로 5분간씩 3회 세척하｝고, dilution buffer로 1:100Q으로 희석한 항체(secondary antibody; alkaHne phosphatase-conjugated mouse anti-human IgE)를 가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. PBS-T (0.05% Tween 20)로 3회 세척한 후, 분리되어 반응 하는 단백질 띠를 확인하기 위하여 기질로서 BCIP/ NBT 용액을 증류수로 1:2로 희석하여 가하고 증류수 로 세척, 건조 후 발색정도를 관찰하였다.
- 05% PBST(washing 및 dilution buffer)로 1: 5로 희석하여 가한 후 실온에서 하룻밤 반응시켰다. PBST(0.05% Tween 20)로 5분간씩 3회 세척하｝고, dilution buffer로 1:100Q으로 희석한 항체(secondary antibody; alkaHne phosphatase-conjugated mouse anti-human IgE)를 가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. PBS-T (0.
- SDS-PAGE로 분리된 단백질은 lbwbin 등'아기 사용한 방법에 따라 Transblot apparatus(Bio-rad Lab. Hercules, CA, U.S.A.)를 이용하여 polyvinylidene difluoride(PVDF)-membrane로 이행시킨 후, 이행된 전위막은 0.1% Tween 20을 함유한 PBS-T(41.5 mM PBS, pH 7.4)로 약 60분동안 실온에서 반응시 켜 비특이적인 단백질 결합을 차단시키고, 1차 항체 (Primary antibody)로서 콩 알레르기 환자의 혈청을 0.05% PBST(washing 및 dilution buffer)로 1: 5로 희석하여 가한 후 실온에서 하룻밤 반응시켰다. PBST(0.
- 각 콩 성분 중 열 및 소화에 안정한 알레르기 유발 ( 원(allergen)을 동정하고, 그 특성을 확인하기 위하여 가열처리 및 가열 후 인공위액 처리를 각각 실시하였다. 가열처리를 위해서는 각 콩을 100℃에서 30분간 가열 후 분쇄하고, crude extract와 동일하게 단백질 c 을 유출시켜 제조하였다. 또한 인공위액처리는 Astwood £ 등13의 방법을 약간 변형하여, 가열처리(100。(3, 30분) 5 한 시료에 미리 37℃로 가온한 0.
- 각 콩 성분 중 열 및 소화에 안정한 알레르기 유발 ( 원(allergen)을 동정하고, 그 특성을 확인하기 위하여 가열처리 및 가열 후 인공위액 처리를 각각 실시하였다. 가열처리를 위해서는 각 콩을 100℃에서 30분간 가열 후 분쇄하고, crude extract와 동일하게 단백질 c 을 유출시켜 제조하였다.
- )등 사용하여 SDS-RYGE를 실시하였다. 간 단히 요약하면, 시험물질을 2XSDS sample buffer로 1:1로 희석흐｝여 100℃에서 약 5분간 끓인 후, 6% stacking gel과 12% separating gel로 구성된 mini gel의 각 lane에 10喝씩(단백질량) loading하고 100V 로 전기영동을 실시한 毛 Coomassie Brilliant Blue R-250, Silver stain kit(Bio-rad Lab. Hercules, CA, U.S.A.)로 염색하여 분리된 단백질 띠를 관찰하였다. 분자량의 확인을 위해서는 SDS-PAGE molecular weight standards(Bio-Rad Lab.
- 그 중 분자량 34kDa 성분은 75%（15/20명）, 50kDa의 성분은 60%（12/20명）, 44kDa의 성분은 40%（8/20명）에서, 75, 70kDa의 성분은 30%（6/20명）에서, 각각 관찰되어 주 알레르기 유발성분으로 생각되었다. 또한 일반적으로 알레르겐으로 작용하는 단백질은 열과 산에서도 안 정한 것으로 알려져 있는바 가열처리 또는 가열 및 인 공위액처리 군에도 혈중 IgE와 결합하는 항원 단백질 성분을 비교 관찰하였다. 그 결과 열처리 시료에서는 crude extract와 비교하여 다소 반응성이 약하지만, 75, 70, 50,44 kD의 성분을 일부 환자에게서 관찰할 수 있었으며, 특히 44kDa성분은 55%（11/20명）에서 관찰 되어, 비교적 열에 안정한 성분으로 생각도었다.
- 4; washing buffer 및 dilution buffer)을 사용하여 각각의 혈청을 1:2 비율로 희석한 후 100山/well씩 가하고 실온에서 overnight 반응시킨 후 dilution buffer로 1:1000 비 율로 희석한 alkaline phosphatase-conjugated mouse anti-human IgE를 lOOpZ/well씩 가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 매 단계마다 washing buffer# 사용하여 3회 세척하였으며, alkaline phosphatase 기질인 PNT(p-nitrophenyl phosphate tablet)를 사용하여 발 색시킨 후, ELISA reader(Molecular Devices Co., Menlo Ibrk, CA, U.S.A.)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정 비교하였다. 모든 건강인과 알레르기 환자의 혈청은 3벌로 하여 흡광도를 측정하여 그 평균 값을 구하였으며, 알레르기 반응이 없는 정상인의 혈 청과 인산완충액을 넣은 well의 평균값을 결과 분석의 대조군으로 활용하였다.
- )를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정 비교하였다. 모든 건강인과 알레르기 환자의 혈청은 3벌로 하여 흡광도를 측정하여 그 평균 값을 구하였으며, 알레르기 반응이 없는 정상인의 혈 청과 인산완충액을 넣은 well의 평균값을 결과 분석의 대조군으로 활용하였다.
- 유전자재조합 콩 및 일반 콩에 대한 알레르기 환자의 IgE 항체의 혈중농도를 측정하고 비교하고자 콩 알레르기 환자의 혈청 및 정상인의 혈청을 이용하여 각각의 콩 crude extract# 항원으로 하여 ELISA를 실시하였다. 그 결과, 알레르기 환자 및 정상인 모두의 경우에서 유전자재조합 콩 과 일반 콩 사이에서 IgE 항체의 반응성에는 유의성 있는 차이를 관찰할 수 없 었으나, 정상인의 경우에는 평균 0.
- 유전자재조합 콩(Roundup Ready™)을 대상으로 crude extract, 열처리, 열 및 인공위액을 처리한 후, SDS-啟GE 및 콩 알레르기 환자의 혈액을 이용한 immunoblot, ELISA를 실시 함으로서, 그 알레르기 유발성을 재래 콩과 비교 평가하고자 하였다.
- 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입콩(Non-GMO)에 존재하는 알레르기 유발성분을 확인 • 동정하고, 각각의 콩 알레르겐을 비교 • 평가하기 위해서 SDS-RkGE 에 의해 분리된 단백질을 PVDF membi筋ne에 이행시 키고, open food challenge test 및 skin prick test 등 임상시험에서 콩에 양성반응을 나타낸 환자(20명) 의 혈청을 반응시킨 후 콩 특이 IgE에 특이적으로 결 합하는 2차 항체에 결합되어 있는 효소에 기질을 작용 하여 발색시켜 분리된 단백질 성분을 확인하였으며, 대 조군으로는 알레르기가 없는 정상인(5명)의 혈청을 사용하여 비교하였다. 그 결과 유전자재조합 콩, 국산 콩, 수입콩(Non-GMO) 모두에서 혈 중 IgE와 결합하는 단백질 성분은 환자에 따라 강한 반응성을 보이는 성분이 약간씩 차이가 있음을 확인할 수 있었으나, crude extact에서는 대략 75, 70,50,44,34 kDa,의 성 분에서 강한 반응성을 관찰할 수 있었다.
- 유전자재조합 콩, 국산 콩, 수입콩(Non-GMO) 추출 물중 단백질 성분을 분리하기 위하여, 각 콩의 crude extract, 열처리한 것(30분), 가열처리 후 인공위액을 각각 10분, 30분 처리한 시료별로 SDS-PAGE> 실시한 후, Coomassie Brilliant Blue R-250 및 Silver stain kit로 각각 염색하여 분리된 단백질의 양상을 비교 관찰하였다. 그 결과 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입콩(Non-GMO) 모두 crude ext壮act의 경우는 대 략 21~97kDa, 열처리 sample에서는 21~55kDa의 성분이 주 단백질 성분임을 관찰할 수 있었다.
- 제조 Crude extract는 Helm등이 사용한 방법'少을 약간 변형하여 사용하였다. 우선 각 콩을 분쇄 후 n-hexan 을 이용하여 3회 지방 성분을 추출하여 제거하고, 감 압하에서 잔류하는 용매를 완전히 제거하였다.
- 특히, 콩은 두부, 두유, 발효식품 등으로 폭넓게 사용되어 국내에서 소비가 많은 식품으로 본 연구에서 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase [EPSPS] 단백질이 삽입됨으로써 제초제 내성 (glyphosate tolerant)을 나타내는")유전자재조합 콩(Roundup Ready™)의 알레르기 유발 가능성을 재래 콩과 비교하여 기존의 알레르기 유발성의 변화를 평가하고자, 임 상시험결과(skin prick test, open food challenge test) 콩에 알레르기 반응을 나타낸 환자의 혈청을 이용하여 ELISA, SDS-RkGE 및 immunoblot을 실시하였다. 한편, 열 및 인공위액을 처리에 따른 알레르기 유발성분의 물리화학적 특성을 평가하여 알레르겐의 열에 대한 안정성과 소화액에 대한 저항성을 비교 평 가하였다.
대상 데이터
- Co.(St. Louis, U.SA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 실험에 사용한 유전자재조합콩 (Roundup Ready(3))은 몬산토사에서, 국산콩 및 수 입콩(Non-GMO)은 국내식품회사로부터 제공받아 사 용하였으며, 각 콩은 식품의약품안전청 식품미생물과 에서 유전자재조합여부를 확인 받아 시험에 사용하였다.
- 3 -IgE binding to soybean fractions isolated on 12 SDS-PAGE western immunoblots with sera of soybean-allergic patient (A) and normal control (B). Four extracts of 3 kinds of soybeans prepared in the laboratory. Four extract groups were composed of crude extract (lane24), heated sample prepared by heating for 30 min (lane57), and both of heat-digest groups prepared by heating for 30 min and incubated in SGF for 10 min (lane810) or 30 min (lanelll3).
- 알레르기 임상진단법인 skin prick test 및 open food challenge test를 실시한 결과, 콩에 알레르기 양성반응이 관찰된 환자의 혈청(20명)을 서울알레르 기 클리닉에서 제공받아 사용하였으며, 각 환자의 임 상적 특징은 Table I에 요약하였다. 또한 각 혈청은 사용할 때까지 -70℃에 보관 후 사용하였으며, 대조 군으로는 알레르기가 없는 정상인의 혈청(5명)을 사용하였다.
- SA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 실험에 사용한 유전자재조합콩 (Roundup Ready(3))은 몬산토사에서, 국산콩 및 수 입콩(Non-GMO)은 국내식품회사로부터 제공받아 사 용하였으며, 각 콩은 식품의약품안전청 식품미생물과 에서 유전자재조합여부를 확인 받아 시험에 사용하였다.
- 알레르기 임상진단법인 skin prick test 및 open food challenge test를 실시한 결과, 콩에 알레르기 양성반응이 관찰된 환자의 혈청(20명)을 서울알레르 기 클리닉에서 제공받아 사용하였으며, 각 환자의 임 상적 특징은 Table I에 요약하였다. 또한 각 혈청은 사용할 때까지 -70℃에 보관 후 사용하였으며, 대조 군으로는 알레르기가 없는 정상인의 혈청(5명)을 사용하였다.
이론/모형
- 유전자재조합 콩, 국산콩, 수입콩(Non-GMO)에 존재하는 단백질을 분리하고, 각 성분을 비교 확인하기 위하여 Laemmli 등")이 사용한 방법에 따라 Mini Protein HI 전기영동 system(Bio-rad Lab. Hercules, CA, USA.)등 사용하여 SDS-RYGE를 실시하였다. 간 단히 요약하면, 시험물질을 2XSDS sample buffer로 1:1로 희석흐｝여 100℃에서 약 5분간 끓인 후, 6% stacking gel과 12% separating gel로 구성된 mini gel의 각 lane에 10喝씩(단백질량) loading하고 100V 로 전기영동을 실시한 毛 Coomassie Brilliant Blue R-250, Silver stain kit(Bio-rad Lab.
- )로 염색하여 분리된 단백질 띠를 관찰하였다. 분자량의 확인을 위해서는 SDS-PAGE molecular weight standards(Bio-Rad Lab. Hercules, CA, USA)를 함께 사용하였다.
성능/효과
- 또한, 혈청 중 IgE와 특이적으로 결합하여 알레르겐 。.루 작용하는 단백질을 확인하고자 immunoblot을 실시한 결과, crude extract에서는 대략 75, 70,50,44, 34 kDa, 열처리한 경우에서는 75, 70,50,44 kDa, 열 처리 및 인공위액을 처리한 경우에서는 50 kDa의 성 분이 주 알레르기 유발성분으로 관찰되었으며, 가열 및 인공위액을 처리함에 따라 대부분의 성분은 원액에 비해 그 반응성이 낮아짐을 관찰할 수 있었으나, 그 중 특히 대락 50 kDa의 성분은 가열 및 인공위액 처리 후 에도 콩 알레르기 환자의 40%(8/20명)에게서 관찰 되어, 비교적 열 및 소화효소에도 안정한 성분으로 사 료되었으나, 국산 콩, 수입 콩(Non-GMO)과 비교하여, 유전자재조합 콩에만 나타나는 특이적인 알레르기 유 발성분은 관찰할 수 없었다. 한편, immimoblot 결과 각 개인마다 알레르기 유발 주성분이 조금씩 다르게 나타났으나, 대부분의 환자에서 공통적으로 관찰되는 혈청 중 IgE와 결합하는 주요성분으로 생각되는 대략 그 분자량이 75,70,50 kDa의 성분은 기존의 콩 알레 르겐 중 0-conglycinin으로, 대략 44 kDa의 성분은 glyciniri의 acidic polypeptide의 일부분酒으로 생각되 었으며, 대략 34 kDa의 성분은 P3%Gly mL으로'少 생 각되었다.
- 1. 각 콩의 crude extract에 대한 IgE 반응성을 ELISA로 측정한 결과 유전자재조합 콩, 국산콩, 수입 콩(Non-GMO)간의 유의성 있는 차이는 관찰할 수 없 었으나, 대부분 콩 알레르기 환자 20명중 11명인 55%가 음성반응 환자의 평균치에 2배 이상 수치를 나타내는 등 대부분의 환자가 비교적 높은 혈중 IgE 수 치를 나타내었다.
- 2. SDS-PAGE 결과, 각 콩의 crude ext壮act의 경우 21~97kDa의 성분이 주 단백질 성분임을 관찰할 수 있었으며, 가열 또는 인공위액처리에 의해 단백질 이 분해됨을 확인할 수 있었으나, 유전자재조합 콩에 만 나타나는 특이적인 단백질 성분이나 기존 단백질의 발현에 미치는 영향은 관찰할 수 없었다.
- 3. hnmunoblot 결과 기존의 콩 알레르겐과 일치흐｝ 는 결과인 crude extract에서는 대략 75,70,50,44, 34 kDa, 열처리한 경우에서는 75, 70, 50, 44 kDa, 열처리 및 인공위액을 처리한 경우에서는 50kDa의 단백질 성분을 주요 알레르기 유발성분으로 관찰할 수 있 었으나, 국산 콩, 수입 콩과 비교하여, 유전자재조합 콩에만 나타나는 특이적인 알레르기 유발성분은 관찰할 수 없었다.
- Crude extract, 열처리, 열 및 인공위액을 처리한 sample을 SDS-RKGE를 실시하여 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입 콩(Non-GMO) 모두 crude extract 의 경우는 대략 21~97kDa, 열처리 sample에서는 21~55kDa의 성분이 주요 단백질 성분임을 관찰할 수 있었으며, 열 및 인공위액을 처리한 경우(10분, 30 분)에는 소화되어 대부분의 성분이 40 kDa이하에서 관 찰되어, 열 및 인공위액을 처리함에 따라, 원액에 비해 일부 단백질 성분이 불활성화되거나 분해되어 소실됨을 확인할 수 있었으며. silver stain 한 결과 가열 처리 또는 인공위액처리에도 분해되지 않은 단백질 성 분이 일부 존재하며, 이는 대부분 glycoprotein으로 사 려된다.
- ")특히, 삽입 유전자인 CP4 EPSPS는 Agrobacterium sp. strain CP4로부터 유래한 것으로 그 분자량 이 47.6 kDa인 것으로 Harrison 등场이 보고하였으 나, 본 실험 중 SDS-PAGE결과 CP4 EPSPS로 생각 되는 단백질 성분은 관찰할 수 없었는데, 이는 삽입 된 CP4 EPSPS단백질이 최대 전체 단백질 함유량의 0.1%정도로 전체적으로는 매우 낮은 함량9)을 차지하는 것에 기인한 결과로 생각된다.
- 그러나, crude extract, 열처리. 가열 후 인공위액(10 분, 30분)처리한 시료 모두에서 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입콩(Non-GMO)간의 단백질 성분의 특별한 차이는 관찰되지 않았으며, 열 및 인공위액을 처리함 에 따라, 원액에 비해 일부 단백질 성분이 불활성화 되거나 분해되어 소실됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 52, 수입콩(Non-GMO)에는 평균 050정도의 흡광도 치를 나타내었다. 각 콩에 대한 혈중 IgE 반응성에는 상호간 유의성 있는 차이를 관찰할 수 없었으며, 대조군으로 사용한 정상인의 혈 중 IgE 수치 또한 유전자재조합 콩에서는 평균 0.18 ±0.08, 국산콩에서는 평균 0.18+0.07, 수입콩(NonGMO)에는 평균 0.19±0.07정도로 나타나, 유전자재조 합 콩과 일반 콩간의 IgE 항체에 대한 반응성의 차이를 관찰할 수는 없었다. 그러나, 정상인과 콩 알레르기 환자의 혈중 특이 IgE 항체 반응성을 비교한 결과 정 상인의 경우에는 평균 0.
- 각각의 콩 단백질에 대한 알레르기 환자의 IgE 항 체의 반응성을 측정 , 비교하고자 Open food challenge test 및 skin prick test등 임상시험에서 콩에 양성반 응을 나타낸 환자(20명) 및 알레르기가 없는 정상인 (5명)의 혈청을 이용하여 ELISA를 실시한 결과, 콩 알레르기 환자의 경우에는 유전자재조합 콩에는 평균 0.53, 국산콩에는 평균 0.52, 수입콩(Non-GMO)에는 평균 050정도의 흡광도 치를 나타내었다. 각 콩에 대한 혈중 IgE 반응성에는 상호간 유의성 있는 차이를 관찰할 수 없었으며, 대조군으로 사용한 정상인의 혈 중 IgE 수치 또한 유전자재조합 콩에서는 평균 0.
- 또한 일반적으로 알레르겐으로 작용하는 단백질은 열과 산에서도 안 정한 것으로 알려져 있는바 가열처리 또는 가열 및 인 공위액처리 군에도 혈중 IgE와 결합하는 항원 단백질 성분을 비교 관찰하였다. 그 결과 열처리 시료에서는 crude extract와 비교하여 다소 반응성이 약하지만, 75, 70, 50,44 kD의 성분을 일부 환자에게서 관찰할 수 있었으며, 특히 44kDa성분은 55%（11/20명）에서 관찰 되어, 비교적 열에 안정한 성분으로 생각도었다. 한편 가열처리 및 인공위액을 처리한 경우에서는（10분, 30 분）에서는 대부분의 단백질이 분해되어 몇몇 환자에게 만 관찰되었으나, 50kDa의 성분은 콩 알레르기 환자 40%（8/20명）에서 관찰되어 비교적 열 및 소화효소에도 안정한 알레르기 유발성분으로 생각되었으며, 인공위 액처리 시간에 따른 유의적인 변화는 관찰되지 않았으 며, 국산콩, 수입콩（Non-GMO）과 비교하여, 유전자재 조합 콩에만 나타나는 특이적인 알레르기 유발성분은 관찰할 수 없었다.
- 유전자재조합 콩, 국산 콩, 수입콩(Non-GMO) 추출 물중 단백질 성분을 분리하기 위하여, 각 콩의 crude extract, 열처리한 것(30분), 가열처리 후 인공위액을 각각 10분, 30분 처리한 시료별로 SDS-PAGE> 실시한 후, Coomassie Brilliant Blue R-250 및 Silver stain kit로 각각 염색하여 분리된 단백질의 양상을 비교 관찰하였다. 그 결과 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입콩(Non-GMO) 모두 crude ext壮act의 경우는 대 략 21~97kDa, 열처리 sample에서는 21~55kDa의 성분이 주 단백질 성분임을 관찰할 수 있었다. 또한 인공위액을 10분 처리한 경우에는 단백질 성분이 소 화되어 대부분의 성분이 40kDa이하에서 관찰되었으 며, 인공위액을 30분 처리한 경우에는 대부분 25kDa이하의 성분이 주 단백질 성분임을 관찰할 수 있었다.
- 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입콩(Non-GMO)에 존재하는 알레르기 유발성분을 확인 • 동정하고, 각각의 콩 알레르겐을 비교 • 평가하기 위해서 SDS-RkGE 에 의해 분리된 단백질을 PVDF membi筋ne에 이행시 키고, open food challenge test 및 skin prick test 등 임상시험에서 콩에 양성반응을 나타낸 환자(20명) 의 혈청을 반응시킨 후 콩 특이 IgE에 특이적으로 결 합하는 2차 항체에 결합되어 있는 효소에 기질을 작용 하여 발색시켜 분리된 단백질 성분을 확인하였으며, 대 조군으로는 알레르기가 없는 정상인(5명)의 혈청을 사용하여 비교하였다. 그 결과 유전자재조합 콩, 국산 콩, 수입콩(Non-GMO) 모두에서 혈 중 IgE와 결합하는 단백질 성분은 환자에 따라 강한 반응성을 보이는 성분이 약간씩 차이가 있음을 확인할 수 있었으나, crude extact에서는 대략 75, 70,50,44,34 kDa,의 성 분에서 강한 반응성을 관찰할 수 있었다. 그 중 분자량 34kDa 성분은 75%（15/20명）, 50kDa의 성분은 60%（12/20명）, 44kDa의 성분은 40%（8/20명）에서, 75, 70kDa의 성분은 30%（6/20명）에서, 각각 관찰되어 주 알레르기 유발성분으로 생각되었다.
- 그 결과 유전자재조합 콩, 국산 콩, 수입콩(Non-GMO) 모두에서 혈 중 IgE와 결합하는 단백질 성분은 환자에 따라 강한 반응성을 보이는 성분이 약간씩 차이가 있음을 확인할 수 있었으나, crude extact에서는 대략 75, 70,50,44,34 kDa,의 성 분에서 강한 반응성을 관찰할 수 있었다. 그 중 분자량 34kDa 성분은 75%（15/20명）, 50kDa의 성분은 60%（12/20명）, 44kDa의 성분은 40%（8/20명）에서, 75, 70kDa의 성분은 30%（6/20명）에서, 각각 관찰되어 주 알레르기 유발성분으로 생각되었다. 또한 일반적으로 알레르겐으로 작용하는 단백질은 열과 산에서도 안 정한 것으로 알려져 있는바 가열처리 또는 가열 및 인 공위액처리 군에도 혈중 IgE와 결합하는 항원 단백질 성분을 비교 관찰하였다.
- 07정도로 나타나, 유전자재조 합 콩과 일반 콩간의 IgE 항체에 대한 반응성의 차이를 관찰할 수는 없었다. 그러나, 정상인과 콩 알레르기 환자의 혈중 특이 IgE 항체 반응성을 비교한 결과 정 상인의 경우에는 평균 0.18정도의 흡광도치를 나타낸 반면, 대부분의 콩 알레르기 환자의 특이 IgE는 0.2~L2정도로 많은 편차를 보였지만, 평균 0.50정도의 흡광도치를 나타내어 정상인의 평균 IgE 수치에 비해 2배 이상의 IgE수치를 나타내었다. 특히 콩 알레 르기 환자 20명중 11명인 55%가 음성반응 환자의 평 균치에 2배 이상이었고, 이 중 8명은 3배 이상의 수치 를 나타내 등 대부분의 콩 알레르기 환자의 혈중 IgE 는 높게 관찰되었고, 단만 2명만이 음성반응 환자의 평균치에 비해 낮은 혈중 IgE 농도를 나타내는 등 알 레르기 환자의 경우는 비교적 높은 혈중 IgE 농도를 나타내었다(Fig.
- 한편 가열처리 및 인공위액을 처리한 경우에서는（10분, 30 분）에서는 대부분의 단백질이 분해되어 몇몇 환자에게 만 관찰되었으나, 50kDa의 성분은 콩 알레르기 환자 40%（8/20명）에서 관찰되어 비교적 열 및 소화효소에도 안정한 알레르기 유발성분으로 생각되었으며, 인공위 액처리 시간에 따른 유의적인 변화는 관찰되지 않았으 며, 국산콩, 수입콩（Non-GMO）과 비교하여, 유전자재 조합 콩에만 나타나는 특이적인 알레르기 유발성분은 관찰할 수 없었다. 또한 이상의 결과로 보아, 대략 75, 70, 50,44,34 kDa,의 성분이 우리나라 환자에게서 주 알레르기유발 성분임을 알 수 있었으며“이는 기존의 콩 알레르겐으로 보고된 성분과 일치하는 결과임을 알 수 있었다（Eble H & Fig. 3）.
- 그 결과 유전자재조합 콩, 국산 콩 및 수입콩(Non-GMO) 모두 crude ext壮act의 경우는 대 략 21~97kDa, 열처리 sample에서는 21~55kDa의 성분이 주 단백질 성분임을 관찰할 수 있었다. 또한 인공위액을 10분 처리한 경우에는 단백질 성분이 소 화되어 대부분의 성분이 40kDa이하에서 관찰되었으 며, 인공위액을 30분 처리한 경우에는 대부분 25kDa이하의 성분이 주 단백질 성분임을 관찰할 수 있었다. 그러나, crude extract, 열처리.
- 이상의 연구결과 유전자재조합 콩은 기존 콩과 비교하여 알레르기 유발성에 별다른 차이를 나타내지 않았 으며, 우리나라 콩 알레르기 환자에게 알레르기을 유 발하는 주요 성분은 70,50,44,34 kDa의 성분으로 사 려 된다.
- 50정도의 흡광도치를 나타내어 정상인의 평균 IgE 수치에 비해 2배 이상의 IgE수치를 나타내었다. 특히 콩 알레 르기 환자 20명중 11명인 55%가 음성반응 환자의 평 균치에 2배 이상이었고, 이 중 8명은 3배 이상의 수치 를 나타내 등 대부분의 콩 알레르기 환자의 혈중 IgE 는 높게 관찰되었고, 단만 2명만이 음성반응 환자의 평균치에 비해 낮은 혈중 IgE 농도를 나타내는 등 알 레르기 환자의 경우는 비교적 높은 혈중 IgE 농도를 나타내었다(Fig. 1).
- 그 결과 열처리 시료에서는 crude extract와 비교하여 다소 반응성이 약하지만, 75, 70, 50,44 kD의 성분을 일부 환자에게서 관찰할 수 있었으며, 특히 44kDa성분은 55%（11/20명）에서 관찰 되어, 비교적 열에 안정한 성분으로 생각도었다. 한편 가열처리 및 인공위액을 처리한 경우에서는（10분, 30 분）에서는 대부분의 단백질이 분해되어 몇몇 환자에게 만 관찰되었으나, 50kDa의 성분은 콩 알레르기 환자 40%（8/20명）에서 관찰되어 비교적 열 및 소화효소에도 안정한 알레르기 유발성분으로 생각되었으며, 인공위 액처리 시간에 따른 유의적인 변화는 관찰되지 않았으 며, 국산콩, 수입콩（Non-GMO）과 비교하여, 유전자재 조합 콩에만 나타나는 특이적인 알레르기 유발성분은 관찰할 수 없었다. 또한 이상의 결과로 보아, 대략 75, 70, 50,44,34 kDa,의 성분이 우리나라 환자에게서 주 알레르기유발 성분임을 알 수 있었으며“이는 기존의 콩 알레르겐으로 보고된 성분과 일치하는 결과임을 알 수 있었다（Eble H & Fig.
- 루 작용하는 단백질을 확인하고자 immunoblot을 실시한 결과, crude extract에서는 대략 75, 70,50,44, 34 kDa, 열처리한 경우에서는 75, 70,50,44 kDa, 열 처리 및 인공위액을 처리한 경우에서는 50 kDa의 성 분이 주 알레르기 유발성분으로 관찰되었으며, 가열 및 인공위액을 처리함에 따라 대부분의 성분은 원액에 비해 그 반응성이 낮아짐을 관찰할 수 있었으나, 그 중 특히 대락 50 kDa의 성분은 가열 및 인공위액 처리 후 에도 콩 알레르기 환자의 40%(8/20명)에게서 관찰 되어, 비교적 열 및 소화효소에도 안정한 성분으로 사 료되었으나, 국산 콩, 수입 콩(Non-GMO)과 비교하여, 유전자재조합 콩에만 나타나는 특이적인 알레르기 유 발성분은 관찰할 수 없었다. 한편, immimoblot 결과 각 개인마다 알레르기 유발 주성분이 조금씩 다르게 나타났으나, 대부분의 환자에서 공통적으로 관찰되는 혈청 중 IgE와 결합하는 주요성분으로 생각되는 대략 그 분자량이 75,70,50 kDa의 성분은 기존의 콩 알레 르겐 중 0-conglycinin으로, 대략 44 kDa의 성분은 glyciniri의 acidic polypeptide의 일부분酒으로 생각되 었으며, 대략 34 kDa의 성분은 P3%Gly mL으로'少 생 각되었다. 비교적 소수의 환자에게서 관찰된 성분 중 대략 30 kDa의 성분은 Gly mfD으로, 24~26kD의 성분은 glycinin의 basic polypeptide 또는 trypsin inhibitor의 일부로 생각되었으나, 명확한 규명을 위해서는 추가연구가 필요할 것으로 사려되며, 85,110, 118 kDa의 성분에 대해서도 아직까지 그 구체적 성분 이 명확히 알려져 있지 않아 그 성분 규명에 대한 추 가적인 연구가 필요한 것으로 사료되었다.
후속연구
- 유전자재조합 콩 및 일반 콩에 대한 알레르기 환자의 IgE 항체의 혈중농도를 측정하고 비교하고자 콩 알레르기 환자의 혈청 및 정상인의 혈청을 이용하여 각각의 콩 crude extract# 항원으로 하여 ELISA를 실시하였다. 그 결과, 알레르기 환자 및 정상인 모두의 경우에서 유전자재조합 콩 과 일반 콩 사이에서 IgE 항체의 반응성에는 유의성 있는 차이를 관찰할 수 없 었으나, 정상인의 경우에는 평균 0.18정도의 흡광도 치 를 나타낸 반면, 콩 알레르기 환자의 경우에는 평균 0.50정도의 흡광도 치를 나타내어 정상인에 비해 2배 이상의 높은 IgE 혈중농도를 나타낸 것으로 보아 대부분의 콩 알레르기 환자는 IgE 항체에 의해 매개된 제 1형 과민반응환자로 생각되었으나, 콩 알레르기 환자의 특이 IgE는 0.2~1.2정도로 큰 편차를 보여, 향후 IgG등 다른 항체에 대한 반응성 평가 등이 추가로 연구되어야 할 것으로 생각되었다.
- 한편, immimoblot 결과 각 개인마다 알레르기 유발 주성분이 조금씩 다르게 나타났으나, 대부분의 환자에서 공통적으로 관찰되는 혈청 중 IgE와 결합하는 주요성분으로 생각되는 대략 그 분자량이 75,70,50 kDa의 성분은 기존의 콩 알레 르겐 중 0-conglycinin으로, 대략 44 kDa의 성분은 glyciniri의 acidic polypeptide의 일부분酒으로 생각되 었으며, 대략 34 kDa의 성분은 P3%Gly mL으로'少 생 각되었다. 비교적 소수의 환자에게서 관찰된 성분 중 대략 30 kDa의 성분은 Gly mfD으로, 24~26kD의 성분은 glycinin의 basic polypeptide 또는 trypsin inhibitor의 일부로 생각되었으나, 명확한 규명을 위해서는 추가연구가 필요할 것으로 사려되며, 85,110, 118 kDa의 성분에 대해서도 아직까지 그 구체적 성분 이 명확히 알려져 있지 않아 그 성분 규명에 대한 추 가적인 연구가 필요한 것으로 사료되었다. 이상의 연 구결과를 통해 유전자재조합 콩은 국산 콩등 재래콩과 비교할 때 알레르기 유발성 측면에서 별다른 차이를 나타내지는 않는 것으로 사료되었으나, 향후 식품알레 르기 반응에 관여하는 다른 항체(IgG, IgA)나, cytokine 의 역할 등에 대한 연구 또한 추가되어야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 연 구결과를 통해 유전자재조합 콩은 국산 콩등 재래콩과 비교할 때 알레르기 유발성 측면에서 별다른 차이를 나타내지는 않는 것으로 사료되었으나, 향후 식품알레 르기 반응에 관여하는 다른 항체(IgG, IgA)나, cytokine 의 역할 등에 대한 연구 또한 추가되어야 할 것으로 생각된다. 식품 알레르기는 인종간, 개인간, 식생활 습 관, 지리적 특성에 따라 많은 차이가 있고 나라마다 알레르기 유발 식품도 다르기 때문에 외국의 연구결과를 그대로 우리나라에 적용하기 어려운 바 우리나라 사람을 대상으로 한 식품 알레르기에 관한 연구가 꾸 준히 진행되어야 될 것으로 생각된다.
- 비교적 소수의 환자에게서 관찰된 성분 중 대략 30 kDa의 성분은 Gly mfD으로, 24~26kD의 성분은 glycinin의 basic polypeptide 또는 trypsin inhibitor의 일부로 생각되었으나, 명확한 규명을 위해서는 추가연구가 필요할 것으로 사려되며, 85,110, 118 kDa의 성분에 대해서도 아직까지 그 구체적 성분 이 명확히 알려져 있지 않아 그 성분 규명에 대한 추 가적인 연구가 필요한 것으로 사료되었다. 이상의 연 구결과를 통해 유전자재조합 콩은 국산 콩등 재래콩과 비교할 때 알레르기 유발성 측면에서 별다른 차이를 나타내지는 않는 것으로 사료되었으나, 향후 식품알레 르기 반응에 관여하는 다른 항체(IgG, IgA)나, cytokine 의 역할 등에 대한 연구 또한 추가되어야 할 것으로 생각된다. 식품 알레르기는 인종간, 개인간, 식생활 습 관, 지리적 특성에 따라 많은 차이가 있고 나라마다 알레르기 유발 식품도 다르기 때문에 외국의 연구결과를 그대로 우리나라에 적용하기 어려운 바 우리나라 사람을 대상으로 한 식품 알레르기에 관한 연구가 꾸 준히 진행되어야 될 것으로 생각된다.
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