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문제 정의
- 본 연구에서는 시험물질 Bisphenol A를 사용하여 개정된 OECD test guideline 420(TG420) 시험법의 확립과 적용방법을 검토하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
가설 설정
- - 모든 시험동물 관찰사항은 체계적으로 기록을 유지 한다.
- - 시험동물이 빈사상태에 있거나, 심한 고통이나 곤란(distress)을 받고 있으면 희생시킨다.
- - 시험이 종결될 때까지 살아있는 시험동물은 체중을 측정하고 희생시킨다.
- -시험동물의 관찰기간은 엄격하게 지정하지는 않는다.
제안 방법
- 개정된 TG420 시험법에 따라 사용할 동물은 무작위로 선택하여 개별 인식 처리를 하였다. 순화 기간은 적어도 5일 이상이 되도록 하고 있는데, 본 연구에서는 시험물질을 투여하기 전에 10일간 시험실내 케이지에서 순화시켰다.
- 개정된 TG420 시험법에 따라 시험동물은 아래와 같은 기준을 가지고 임상증상을 관찰하고 체중 및 병리학적검사를 하였다.
- 개정된 TG420시험법에 따라 각 군의 시험동물은 평균 체중 ±20% 이내로 선별하여 예비시험용으로 5 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏, 2000 ㎎/㎏ 등 4가지 투여농도별로 한 마리씩을 두고, 본시험용으로 각 군당 5마리씩(예비시험용 동물 포함) 4개군으로 군구성을 하였다.
- 주요 개정내용을 살펴보면, 시험물질 고정투여량을 5, 50, 500, 2000 ㎎/㎏에서 5, 50, 300,2000㎎/㎏으로 조정하였으며, 개정전의 시험법에는 예비시험용으로 각 군당 시험동물을 한 마리씩 사용하고 본시 험에서는 각 군별로 암수 각 5마리씩을 사용하였으나, 개정된 TG420 시험법에서는 예비시험용 동물수를 포함하여 각 군당 암컷 5마리로 줄였다. 개정된 TG420시험법의 시험수행원칙을 살펴보면, 적당한 투여농도를 사용하여 시험동물이 심한 고통이나 스트레스를 받지 않도록 하며 사망 동물이 발생할 수 있는 투여 농도는 피하고, 빈사상태의 동물은 안락사 시켜 시험 중 사망동물로 간주토록 하였다. 또한 시험수행 전에 시험물질의 구조와 특성, 물리화학적 성질, 관련 독성시험결과, 구조적으로 관련된 물질의 독성 자료, 예측되는 용도 등 시험물질정보에 대한 충분한 검토를 거쳐 적당한 초기투여농도를 설정하여 예비시험을 실시한 다음, 시험동물의 독성발현정도에 따라 계단식 고정용량을 적용하여 본시험을 수행토록 하였다(Anmlex 1, 2).
- 개정된 TG420시험법의 시험수행원칙을 살펴보면, 적당한 투여농도를 사용하여 시험동물이 심한 고통이나 스트레스를 받지 않도록 하며 사망 동물이 발생할 수 있는 투여 농도는 피하고, 빈사상태의 동물은 안락사 시켜 시험 중 사망동물로 간주토록 하였다. 또한 시험수행 전에 시험물질의 구조와 특성, 물리화학적 성질, 관련 독성시험결과, 구조적으로 관련된 물질의 독성 자료, 예측되는 용도 등 시험물질정보에 대한 충분한 검토를 거쳐 적당한 초기투여농도를 설정하여 예비시험을 실시한 다음, 시험동물의 독성발현정도에 따라 계단식 고정용량을 적용하여 본시험을 수행토록 하였다(Anmlex 1, 2).
- 이때 각 투여 동물 간의 시간적 간격은 충분히 유지하여, 먼저 투여한 동물의 생존여부를 충분히 판단할 수 있어야한다. 만약 두 번째 사망동물이 발생하면 시험을 즉시 중단하고 더 이상 동물에 시험물질을 투여하지 않고 GHS Class 1로 분류하고, 5 ㎎/㎏을 투여한 5마리 시험동물 가운데 한 마리만 사망하면, GHS Class 2로 분류한다.
- 본시험의 각 투 여농도 단계별 투여시간은 3-4일의 간격을 유지하라고 하였다. 본 연구에서는 시험물질의 LD50가 3,250 ㎎/㎏ 이라는 독성정보를 입수하여 초기투여량은 2000 ㎎/㎏으로 정하고, 예비시험용 동물 한 마리에 2000 ㎎/㎏을 투여하였다. 투여 후 24시간 동안 특별한 증상이 발현되지 않아 본시험 초기투여용량도 2000 ㎎/㎏으로 정하고 4마리의 시험동물에 2000 ㎎/㎏을 투여하고, 4일 동안 관찰하였으나 특별한 독성발현 증상을 보이지 않아, 5 ㎎/㎏ 군, 50 ㎎/㎏ 군, 300 ㎎/㎏ 군에는 시험물질을 투여하지 않고, 2000 ㎎/㎏ 투여군만 14일간 관찰하였다.
- 독성이 낮은 물질에 적용할 수 있는 한도시험법은 예비시험으로 시험동물 한 마리에 2000 ㎎/㎏(특별한 경우에는 5000 ㎎/㎏)을 투여하고 본 시험에 동일용량을 4마리의 추가 동물에 투여하는 방법으로 시험물질이 무독성일 가능성이 많을 때 사용할 수 있는 방법이다. 본 연구에서도 시험동물 군구성을 5 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏, 2000 ㎎/㎏ 등으로 구성하였지만, 시험물질의 독성이 낮아 2000 ㎎/㎏ 군 5마리에만 시험물질을 투여하여 임상증상관찰 후 시험을 종료하였다. 시험 결과, 시험물질은 2000 ㎎/㎏ 급성경구투여시험에서 시험물질에 의한 영향은 없는 것으로 판단되어 GHS(Globally Harmonised System) class 5/unclassified 로 분류되었다.
- 시험물질을 나누어 줄 경우(24시간 이내)에는 시험물질 투여기간을 고려하여 사료와 물을 공급하는 것이 필요하다. 본 연구에서도 시험물질투여 전에 시험동물은 하룻밤 절식시켰으며, 시험물질은 각 단계별 농도로 4 ml씩 일정한 용량으로 증류수에 혼합 조제 하여 투여 당일 오전 2 ml, 오후 2 ml 2회 분할하여 투여 직전에 흔들어서 농도를 균일하게 한 후 죤데를 이용하여 투여하였다. 시험동물에 시험물질투여 후 4시간 동안은 사료를 제한하였으며, 시험기간 동안 물은 계속 공급하였다.
- 시험물질이 안정성이 없다면, 투여하기 직전에 제조되어야 한다. 시험물질 투여는 적당한 죤데 등의 삽입관을 사용하여 단회용량으로 투여한다. 단회용량투여가 불가능할 경우에는 시험물질을 나누6 줄 수 있으나, 24시간을 초과하지 않는다.
- 종래의 TG420 시험법과 개정된 TG420 시험법을 비교해 보면, 사용하는 시험동물수는 기존 시험법에서는 예비시험에 사용하는 동물수는 각 군당 암컷 5마리 이하, 본시 험에서는 각 시험군당 암수 각각 5마리를 사용하였으나, 개정된 시험법에서는 예비시험용으로 각 투여농도별로 암 컷 1마리를 사용하고 예비시험에 사용된 시험동물을 포함하여 본시험에서는 각 군별로 암컷 5마리를 사용하도록 되어 있다. 즉 개정된 시험법에서는 사용하는 시험동물수 를 예비시험에서는 1/5로 줄였고, 본시험에서는 4/10로 줄였다.
- 본 연구에서는 시험물질의 LD50가 3,250 ㎎/㎏ 이라는 독성정보를 입수하여 초기투여량은 2000 ㎎/㎏으로 정하고, 예비시험용 동물 한 마리에 2000 ㎎/㎏을 투여하였다. 투여 후 24시간 동안 특별한 증상이 발현되지 않아 본시험 초기투여용량도 2000 ㎎/㎏으로 정하고 4마리의 시험동물에 2000 ㎎/㎏을 투여하고, 4일 동안 관찰하였으나 특별한 독성발현 증상을 보이지 않아, 5 ㎎/㎏ 군, 50 ㎎/㎏ 군, 300 ㎎/㎏ 군에는 시험물질을 투여하지 않고, 2000 ㎎/㎏ 투여군만 14일간 관찰하였다.
대상 데이터
- 그러나 개정된 TG420 시험법은 투여군 간의 투여시간를 3~4일 두어야 하기 때문에 동일한 주령의 시험동물을 도입하여 투여군 별로 체중변화를 즉정할 경우 군구성 후 시험물질 투여시, 시험기간 주 시험동물을 희생시킬 때 투여군 별로 시험동물의 주령 차이가 발생하게 되는 단점이 있다. 개정된 TG420 시험법의 확립과 적용방법을 검토하기 위하여 본 연 구에 사용된 시험물질은 LD50이 3, 250 mg/kg으로(NIOSH, 1999) 독성이 낮은 물질이다. 독성이 낮은 물질에 적용할 수 있는 한도시험법은 예비시험으로 시험동물 한 마리에 2000 ㎎/㎏(특별한 경우에는 5000 ㎎/㎏)을 투여하고 본 시험에 동일용량을 4마리의 추가 동물에 투여하는 방법으로 시험물질이 무독성일 가능성이 많을 때 사용할 수 있는 방법이다.
- 시험 결과, 시험물질은 2000 ㎎/㎏ 급성경구투여시험에서 시험물질에 의한 영향은 없는 것으로 판단되어 GHS(Globally Harmonised System) class 5/unclassified 로 분류되었다. 본 연구에 실제로 사용된 시험동물수는 5마리에 불과하여 기존의 급성경구독성시험법에 비하여는 획기적으로 사용 시험동물수를 출였다고 할 수 있다. 개정된 TG420 시험법에 따라 시험물질에 대한 급성경구독성시험을 수행하여 개정된 시험법을 검토한 결과, 독성이 낮을 것으로 예측되는 시험물질의 경우에는 2000㎎/㎏ 농도부터 적용하여 점차 낮은 농도를 적용시키고, 독성이 높을 것으로 예측되는 시험물질의 경우에는 5 ㎎/㎏ 농도부터 적용하여 점차 높은 농도를 적용시키고, 독성자료가 충분치 않을 경우에는 중간 농도인 300 ㎎/㎏ 농도를 적용시키는 방법이 가장 동물복지를 고려하고, 시험동물수를 줄일 수 있는 방법이 될 것으로 판단되었다.
- 개정된 TG420 시험법에 의하면, 시험물질에 관한 내용에는 시험물질의 성질, 순도, 물리화학적 특성(이성체 포함), CAS 번호 등의 확인자료와 물을 부형제로 사용하지 않고 다른 적절한 부형제를 사용하였을 경우, 적용한 부형제 선택의 정당성에 관한 내용이 포함되도록 되어 있다. 본 연구에서는 시험물질로 Bisphenol A를 사용하였다.Bisphenol A(CAS No.
- 수컷 랫드를 사용할 때는 정당성을 입증할 수 있어야 한다고 되어 있다. 본 연구에서는 출산 경험이 없고 임신되어 있지 않는 건강한 8주령의 암컷 S.D랫드를 바이오제노믹스사로부터 도입하여 사용하였다.
- 제품(5L79) 고형사료를 공급받아 사용하였다. 실험동물은 개별 인식 처리한 후 각각의 동물을 관찰하는데 방해가 되지 않는 범위에서 폴리보네이트 케이지에 투여용량별로 5마리씩 구성하여 사육하였다.
- 본 연구에서도 시험동물에게 물은 제한 없이 공급하였으며, 랫드용 사료는 살균처리 된 PMI NUTRITION INTERNATIONAL, INC. 제품(5L79) 고형사료를 공급받아 사용하였다. 실험동물은 개별 인식 처리한 후 각각의 동물을 관찰하는데 방해가 되지 않는 범위에서 폴리보네이트 케이지에 투여용량별로 5마리씩 구성하여 사육하였다.
이론/모형
- 80-05-7, C15H16O2)fe 랫드에 경구로 투여한 결과 L%)이 3, 250 ㎎/㎏으로 나타나있다(NIOSH, 1999). 본 연구에서는 이 시험자료를 근거로 개정된 TG420 시험법에 따라 예비시험의 초기투여량은 2000 ㎎/㎏으로 정하고 예비시험과 본시험을 실시하였다.
성능/효과
- 본 연구에 실제로 사용된 시험동물수는 5마리에 불과하여 기존의 급성경구독성시험법에 비하여는 획기적으로 사용 시험동물수를 출였다고 할 수 있다. 개정된 TG420 시험법에 따라 시험물질에 대한 급성경구독성시험을 수행하여 개정된 시험법을 검토한 결과, 독성이 낮을 것으로 예측되는 시험물질의 경우에는 2000㎎/㎏ 농도부터 적용하여 점차 낮은 농도를 적용시키고, 독성이 높을 것으로 예측되는 시험물질의 경우에는 5 ㎎/㎏ 농도부터 적용하여 점차 높은 농도를 적용시키고, 독성자료가 충분치 않을 경우에는 중간 농도인 300 ㎎/㎏ 농도를 적용시키는 방법이 가장 동물복지를 고려하고, 시험동물수를 줄일 수 있는 방법이 될 것으로 판단되었다. 그러나 본 시험에서 볼 수 있는 것처럼 개정된 TG420 시험법에서는 대조군을 두지 않고, 초기 투여농도군에서 사망동물이 나타나거나 뚜렷한 독성을 보이는 시험군이 있거나, 2000 ㎎/㎏ 투여군에서 독성이 나타나지 않으면 시험을 종료하기 때문에 각 군간의 통계적 유의성을 평가를 할 수는 없는 아쉬움이 있고, 개정된 TG420 시험법에는 기본적으로 시험을 수행하기 위해서는 20마리의 시험동물이 필요한데, 시험물질의 독성정도와 초기투여농도의 선택에 따라 준비한 시험동물 중 일부만을 사용하는 경우가 생기어 잔여 동물을 의미 없이 처리해야 하는 단점이 있다.
- 본 연구에서도 시험동물 군구성을 5 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏, 300 ㎎/㎏, 2000 ㎎/㎏ 등으로 구성하였지만, 시험물질의 독성이 낮아 2000 ㎎/㎏ 군 5마리에만 시험물질을 투여하여 임상증상관찰 후 시험을 종료하였다. 시험 결과, 시험물질은 2000 ㎎/㎏ 급성경구투여시험에서 시험물질에 의한 영향은 없는 것으로 판단되어 GHS(Globally Harmonised System) class 5/unclassified 로 분류되었다. 본 연구에 실제로 사용된 시험동물수는 5마리에 불과하여 기존의 급성경구독성시험법에 비하여는 획기적으로 사용 시험동물수를 출였다고 할 수 있다.
- 시험 종료 후 2000 ㎎/㎏ 투여군 5마리를 부검하여 육안적 해부소견을 관찰하였으나, 간장, 비장, 생식기, 폐, 심장, 신장, 부신 등 모든 장기에서 시험물질에 의한 어떠한 육안소견도 발견되지 않았다(Table 3).
- 최근 시험동물수를 줄이고 시험동물의 고통을 줄이려는 노력이 시도되면서 OECD에 서는 test guideline 401 급성경구독성 시험법을 삭제하고, 1992년 제정된 test guideline 420을 2001년 새로 개정하고 있다(OECD, 2001). 주요 개정내용을 살펴보면, 시험물질 고정투여량을 5, 50, 500, 2000 ㎎/㎏에서 5, 50, 300,2000㎎/㎏으로 조정하였으며, 개정전의 시험법에는 예비시험용으로 각 군당 시험동물을 한 마리씩 사용하고 본시 험에서는 각 군별로 암수 각 5마리씩을 사용하였으나, 개정된 TG420 시험법에서는 예비시험용 동물수를 포함하여 각 군당 암컷 5마리로 줄였다. 개정된 TG420시험법의 시험수행원칙을 살펴보면, 적당한 투여농도를 사용하여 시험동물이 심한 고통이나 스트레스를 받지 않도록 하며 사망 동물이 발생할 수 있는 투여 농도는 피하고, 빈사상태의 동물은 안락사 시켜 시험 중 사망동물로 간주토록 하였다.
- 종래의 TG420 시험법과 개정된 TG420 시험법을 비교해 보면, 사용하는 시험동물수는 기존 시험법에서는 예비시험에 사용하는 동물수는 각 군당 암컷 5마리 이하, 본시 험에서는 각 시험군당 암수 각각 5마리를 사용하였으나, 개정된 시험법에서는 예비시험용으로 각 투여농도별로 암 컷 1마리를 사용하고 예비시험에 사용된 시험동물을 포함하여 본시험에서는 각 군별로 암컷 5마리를 사용하도록 되어 있다. 즉 개정된 시험법에서는 사용하는 시험동물수 를 예비시험에서는 1/5로 줄였고, 본시험에서는 4/10로 줄였다. 투여농도도 개정된 시험법에서는 4가지 투여농도 중 500 ㎎/㎏ 투여농도를 300 ㎎/㎏ 투여농도로 낮추어 시험동물에 대한 복지 수준을 높였다.
- 체중의 변화는 Table 2에서 보는 바와 같이 시험물질 2000 ㎎/㎏ 투여 후 7일에는 정상적인 체중증가를 보였으나, 투여 후 11일에는 전반적으로 체중증가가 둔화되었다. 즉, 1번 시험동물은 비교적 정상적인 체중증가를 보였으나, 2번과 3번 동물은 체중 증가가 다소 둔화되었으며, 4번과 5번 시험동물은 체중증 가가 거의 이루어지지 않았다.
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