전염성기관지염 및 뉴캣슬병 백신을 접종한육계에서 ELISA 및 HI 항체가 비교 Comparison of ELISA and HI titers in broiler chicks vaccinated with infectious bronchitis virus and Newcastle disease virus원문보기
To compare of serum antibody titers using ELISA and HI, serum samples were collected from 100 breeders and their progeny 550 broilers. The breeders and broilers were vaccinated with infectious bronchitis(IB)- and Newcastle disease(ND)-viruses according to general vaccination program. The antibodies ...
To compare of serum antibody titers using ELISA and HI, serum samples were collected from 100 breeders and their progeny 550 broilers. The breeders and broilers were vaccinated with infectious bronchitis(IB)- and Newcastle disease(ND)-viruses according to general vaccination program. The antibodies in serum samples against IB and ND viruses were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) using commercial ELISA kit and hemagglutination inhibition(HI) test. Geometric mean titer(GMT) of ELISA and In titers were monitored from 1-day-old to 35-day-old broilers and compared to those of breeder chickens. The antibody titers of breeders vaccinated with ]B virus showed 47,800, ELISA and 7.2, HI, respectively. Progeny chicks, 1-day-old, vaccinated with IBV showed high antibody titers than those of breed chickens. Those chicks were maintained protective antibody levels until 11-day-old. From 14-day-old, the antibody level decreased below protective levels. In ND, breeders serum antibody titers ELISA and Eiu were 30,200 GMT and 8.7 HI titer, respectively. On 1-day-old chicks, antibody levels was decreased to half in ELISA(16,270) compared with those of breeders, but In titers was 7.4. Progeny broilers, protective antibody level was maintained until 14- day-old by ELISA, but at 11-day-old by HI titers. After then, ND antibody titer was continuously decreased underdefense level. These result indicated that the ELISA method be more sensitive than HI titration to detect serum antibody level for IBV and NDV.
To compare of serum antibody titers using ELISA and HI, serum samples were collected from 100 breeders and their progeny 550 broilers. The breeders and broilers were vaccinated with infectious bronchitis(IB)- and Newcastle disease(ND)-viruses according to general vaccination program. The antibodies in serum samples against IB and ND viruses were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) using commercial ELISA kit and hemagglutination inhibition(HI) test. Geometric mean titer(GMT) of ELISA and In titers were monitored from 1-day-old to 35-day-old broilers and compared to those of breeder chickens. The antibody titers of breeders vaccinated with ]B virus showed 47,800, ELISA and 7.2, HI, respectively. Progeny chicks, 1-day-old, vaccinated with IBV showed high antibody titers than those of breed chickens. Those chicks were maintained protective antibody levels until 11-day-old. From 14-day-old, the antibody level decreased below protective levels. In ND, breeders serum antibody titers ELISA and Eiu were 30,200 GMT and 8.7 HI titer, respectively. On 1-day-old chicks, antibody levels was decreased to half in ELISA(16,270) compared with those of breeders, but In titers was 7.4. Progeny broilers, protective antibody level was maintained until 14- day-old by ELISA, but at 11-day-old by HI titers. After then, ND antibody titer was continuously decreased underdefense level. These result indicated that the ELISA method be more sensitive than HI titration to detect serum antibody level for IBV and NDV.
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제안 방법
HI test에서는 혈구응집억제가 일어나는 최고 희석배수의 역수를 log2 값으로 환산하여 HI titer를 산출하였다.
IB 및 ND에 대한 HI 항체가 측정은 기존의 술식에 준하여 실시하였으며, 먼저 HA test를 실시하여 IBV 및 NDV 항원의 응집역가를 측정하였다.
IB 에 대한 각 가검혈청의 항체가는 V- bottomed microplate(96 well)에서 항원농도 4 HA units, 1% 닭적혈구 부유액을 이용하여 측정하였다10). 이때 가검혈청(0.
ND에 대한 각 가검혈청의 항체가는 U- bottomed microplate(96 well)을 사용하여 항원농도 4 HA units, 1% 닭 적혈구 부유액을 이용하여 측정하였다11,12). 이때 가검혈청(0.
025ml) 가하여 혼합한 다음 실온에서 20분간 감작하였다. 그 후 1% 닭적혈구 부유액(0.025 ml)을 첨가하여 혼합하고 실온에서 40분간 정치한 다음 판독하였다.
요약하면, 먼저 희석용 plate(96 well)을 준비하여 각 well에 가검혈청 6μl를 넣어 희석 용액 300μl로 희석하고, eppendorf tube에 표준음성혈청 및 표준양성혈청을 동일하게 희석하였다. 그 후, 각각 IB, ND의 항원이 코팅된 ELISA plate 의 각 well에 희석 용액 50μl를 첨가하고, 전술한 바와 같이 희석한 가검혈청 50μl와 표준양성혈청(Al, A3, H11 well), 표준음성혈청(A2, H10, H12 well)을 동량 분주한 다음 30분간 상온에서 반응시켰다. 그 후, 각 well의 반응액을 제거하고, 세척용액으로 3회 세척한 후, peroxidase conju-gated anti-chicken Ig G(H+L, 1 : 100 dilution) 100μl를 각 well에 첨가하여, 상온에서 30분간 반응시켰다.
따라서 본 실험에서는 양계농장의 자체 백신 접종 프로그램에 따라 예방접종을 실시한 모계, 그리고 이들이 생산한 계란을 부화시킨 후 대 병아리를 대상으로, IB 및 ND에 대한 일령 별 혈중항체가를 ELISA 및 HI test로 측정하고, 두 검사 방법에 따른 혈중 항체가의 진단적 유의성을 비교하였다.
모계 및 후대 육계에서 전염성기관지염과 뉴캣슬병에 대한 혈중항체가를 시판중인 ELISA kit 및 HI test로 측정하여 비교한 결과는 다음과 같다.
본 실험에서는 현재 국내 양계농장에서 실시하는 백신프로그램(Table 1, 2)에 준하여, 전염성기관지염 및 뉴캣슬병에 대한 백신을 실시한 종계와 후대육계의 혈중항체가의 변동을 ELISA 및 HI test로 측정하여 비교하였다.
025ml) 가하여 혼합한 다음 4°C에서 40분간 감작하였다. 여기에 1% 닭적혈구 부유액(0.025ml)을 첨가하고 잘 혼합하여 4P에서 40분간 정치한 후에 판독하였다.
대상 데이터
모계(Gobb종)는 익산지역 종계장에서 Table 1과 같은 자체 백신 프로그램에 따라 예방접종을 실시하고 관리되어온 30주령 100수와, 종계군에서 산란된 계란을 부화시켜 농장자체 백신프로그램에 따라 Table 2와 같이 예방접종을 실시한 후대 육계 550수를 실험 대상으로 하였다.
모계는 30주령 100수를 익하정맥에서, 후대 육계는 1일령부터 출하시기인 35일령까지 3〜4일 간격으로 각각 50수씩 심장에서 채혈하였다. 혈청은 실온에서 혈액을 응고시킨다음, 원심분리(2, 000rpm, 10min)하여 분리하였고, 56°C, 30분간 비동화시킨 다음, 사용할 때까지 -20°C에 보관하였다.
이론/모형
ELISA의 가검혈청 항체가는 각각 시판중인 IB와 ND ELISA kit(KPL Laboratory Inc., Gaithersburg, MD)의 계산방법에 준하여 geometric mean titers(GMT)를 계산하였다.
IB 및 ND에 대한 각각의 가검혈청내의 항체가는 시판중인 IB, ND ELISA kit(ProFLOK IB, ND ELISA kit ; Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD)를 이용하여 kit의 방법에 준하여 검사하였다.
성능/효과
1일령에 생독백신을 spray 접종한 계군에서는 11일령까지 방어항체가보다 높은 혈중항체가를 유지하였다. ELISA의 경우 1일령 이후의 항체가는 검사일령의 증가에 따라 계속하여 절 반 수준으로 급격히 감소되어 19일령 이후에는 거의 소실되는 결과를 보였으나, HI test에서는 항체가의 감소가 ELISA보다 완만하게 감소됨을 확인할 수 있었다, 그러나 출하일령인 35일령에서는 비록 방어수준에는 미치지 못하였으나 두 시험법에서 모두 혈중항체가가 다소 상승하여 21〜25일령의 수준을 보였다(Fig 1). 혈구응집억제시험과 혈청중화시험법으로 모체 이행항체를 검사한 결과 5~6일령에 모체이행체의 수준이 절반으로 저하된다는 Darbyshire 와 Peters의 보고20)와 모계에 백신투여시 모체이행항체가 5일령까지 방어항체가 수준을 유지하였고 13일령에는 거의 소실된다고 고 등21)은 보고하였으나, 본 실험에서는 후대 병아리에 백신접종을 하였을 경우 야외감염 방어수준의 항체가가 5〜6일 정도 더 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
ND에 대한 30주령 모계의 ELISA GMT는 평균 30, 200이었으며, 후대 병아리 1일령은 평균 16, 270으로 모계보다 낮았다. 이후 항체가는 계속 감소되었으나 14일령까지는 평균 1, 870으로 방어항체가(>1, 800) 수준을 유지하였다.
4로 감소의 폭이 다소 낮았다. 그후 ELISA에서는 14일령까지 1, 870으로 야외감염 방어항체가 이상을 유지하였으나, HI test는 이보다 빠른 11일령까지만 방어항체가 수준을 유지하였다. 한편, 19일령부터는 항체가가 급격히 감소되기 시작하여 32일령에는 거의 소실되었으나 35일령에는 약간 상승하는 추세를 보였다.
뉴캣슬병에 대한 모계군 및 후대 육계의 혈중항체가를 검사한 결과 ELISA는 14일령까지(> 1, 800), HI test은 11일령까지(> 5.0) 야외감염 방어항체수준을 유지하였다. 일령이 증가함에 따라 항체가는 지속적으로 감소되어 거의 소실되었으나, 출하시기인 35일령에는 HI test 에서는 21일령, ELISA는 19일령의 수준으로 상승하였다.
2로서 두 시험법 모두에서 모계보다 높은 항체가를 보유하였다. 두 시험법 모두 11일령까지 각각 5, 700 및 5.1로 야외감염 방어항체가 이상을 유지하였으나, 19일령 이후부터는 낮은 항체가가 유지되다가 출하일령인 35일령에 약간 상승되었다.
모계의 HI titer는 평균 7.0이었고, 후대 병아 리 1일령은 평균 7.2로 모계보다 높은 수준의 항체가를 보였으며, 이후 계속 반감되었으나 11일령(5.1)까지 야외감염 방어수준의 항체가를 보유하였다. 그러나 14일령 이후 계속하여 감소되어 출하일령까지 야외감염에 대한 방어수준의 항체가를 유지하지 못하였다(Table 3, Fig 1).
모계의 HI titer는 평균 8.7이었으며, 후대 병아리 1일령은 모계보다 낮은 수준인 평균 7.4로 나타났다. 이후 항체가는 계속 감소하였으나 11일령까지 평균 5.
이상의 ELISA와 HI test로 측정한 IB 및 ND에 대한 항체가를 비교해서 볼 때, ELISA 가 HI test 보다 일령이 증가에 따른 평균항체가의 감소폭의 변화가 심하였다. 그러나 두 시험법에 의해 측정된 일령의 증가에 따른 평균 항체가의 하강곡선은 비슷한 양상을 보였다(Fig 1 및 2).
전염성기관지염에 대한 30주령 모계의 ELISA GMT와 HI titer의 평균치는 각각 47, 800 및 7.2로서 야외감염 방어항체가 수준보다 높게 나타났으며, 후대 병아리 1일령에서 ELISA GMT는 평균 57, 620, HI titer는 평균 7.2로서 두 시험법 모두에서 모계보다 높은 항체가를 보유하였다. 두 시험법 모두 11일령까지 각각 5, 700 및 5.
전염성기관지염에 대한 혈중항체가 측정 결과 ELISA 및 HI test 두 시험법 모두 모계에 비하여 1일령 후대병아리에서 높은 항체가를 보유하고 있는 것으로 나타났다. 항체가의 감소 정도에 차이는 있으나, 일령의 증가함에 따라 항체가 하강 곡선은 두 시험법 모두 비슷한 양상을 보여 주었다.
ELISA검사법이 HI test에 비해 항체가의 감소폭이 컸지만, 일령이 증가함에 따라 항체가의 하강곡선은 두 시험법 모두 비슷한 양상을 보였다. 특히, 모계와 J일령의 항체가를 비교할 때 HI test의 항체가는 평균 8.7에서 7.4로 감소하였지만, ELISA에서는 절반 수준으로 감소되어 더욱 민감한 결과를 나타냈 다(Fig 2). 최 등25)은 HI test로 측정한 1일령의 모체이행항체가가 평균 4±0.
7로 높은 수준을 유지하였다. 후대 병아리는 1일령에서 ELISA GMT는 평균 16, 270으로 반절 수준으로 감소한 반면 HI titer는 평균 7.4로 감소의 폭이 다소 낮았다. 그후 ELISA에서는 14일령까지 1, 870으로 야외감염 방어항체가 이상을 유지하였으나, HI test는 이보다 빠른 11일령까지만 방어항체가 수준을 유지하였다.
후속연구
따라서, 계군의 면역능을 파악하기 위하여는 질병에 따라 집중적으로 검사하여야 할 면역글로블린의 종류를 확인하여 ELISA와 일반 혈청학적 검사를 병행하여 실시하고 이들 검사결과의 상관관계를 상호 비교ㆍ평가한 후, 계군에 대한 혈중항체가를 측정하여 예방접종 프로그램을 작성하는 것이 좋을 것으로 사료되었다.
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