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문제 정의
- 따라서 본 실험은 저 광도에서 광흡수 효율이 높아 빛 에너지를 효율적으로 화학에너지로 변환시킬 담배의 하위엽의광합성 효율을 좀 더 높이고자 고려 인삼으로부터 에너지의 변환에 핵심적인 역할을 하고 있는 유전자 중 CAB 유전자를 담배에 도입하여 형질전환 식물체를 선발하여 그 생리적 특성을 조사함으로써 담배의 하위엽 품질 향상에 기여하고자 한다.
제안 방법
- CAB 유전자로 형질전환된 담배 2세대 식물체의 도입된 CAB 유전자 존재여부를 genomic PCR 방법으로 각 계통에서 확인하였다. CAB 유전자로 형질전환된 2세대 식물체를 자연광 조건과 90% 차광된 온실에서 각각 생육시킨 결과 형질전환 식물체의 광합성능 정도는 정상 식물체와 유사하거나 약간 높은 경향이었으며, 광포화점은 형질전환 담배 식물체나 정상 식물체 모두 500/zmol m-2s-1로 차이가 없었다.
- 유전자의 존재여부를 확인하였다. 식물체의 형질전환 여부는 재분화 식물체에서 정제한 genomic DNA를 template로 하고 인삼 CAB 유전자 염기서열에 따라 합성된 5'-primer (5'-tctagaaatggctgcttccacaat)와 3'-primer (5f- ggatccaattcacaaacaattcu)를 이용하여 PCR한 후 890 bp 크기의 DNA 단편이 합성되는지 여부로 확인하였다.
- 1999). 인삼 CAB 유전자로 형질전환된 연초 2세대 식물체의 도입된 cab 유전자 존재여부를 primer를 사용한 genomic PCR 방법으로 조사하였으며 그 결과는 figure 3과 같다. 형질전환 2세대 식물체 C2, C3, C7, C9, CH, C14, C16 (Figure 3, lane 1 - 7)의 각계통에서 도입된 유전자를 primer 에 의해 합성된 DNAband를 확인하였고 정상 연초 NC82에서는 band가 확인되지 않았다(Figure 3, lane 8 and 9).
- 인삼 cDNA clone중 연초 CAB 유전자와 그 염기서열상 유사성 이 높은 pKGCAB (GenBank Accession No. AF 034 631) clone을 PCR을 이용하여 transit peptide와 poly A를 포함하는 0.99 kb 단편을 식물 발현 벡터인 pBI121 에 cloning하였다 (Figure 1). 재조합된 식물발현 벡터 pCAB plasmid를 Agrobacterium tumefaciens LBA 4404에 도입하 였으며, 형질전환된 균주를 담배잎 절편에 동시배양법에 의하 여 형질전환을 시도하였으며 kanamycin이 포함된 shoot 유기 배지에서 재분화 식물체를 획득하였다.
- 99 kb 단편을 식물 발현 벡터인 pBI121 에 cloning하였다 (Figure 1). 재조합된 식물발현 벡터 pCAB plasmid를 Agrobacterium tumefaciens LBA 4404에 도입하 였으며, 형질전환된 균주를 담배잎 절편에 동시배양법에 의하 여 형질전환을 시도하였으며 kanamycin이 포함된 shoot 유기 배지에서 재분화 식물체를 획득하였다.
- 저광도에서도 광합성 효율이 높은 인삼의 광합성능을 제고 시키는 CAB 유전자를 식물발현벡터인 pBI121 에 재조합한 pCAB plasmid (Figure 1)를 A. tumefaciens LBA4404에 도 입하여 연초 (Nicotiana tabacum cv. NC82)의 형질전환 실 험에 계속하여 사용하였으며 형질전환된 연초의 엽육조직을 shoot 유기배지에 치상하여 다수의 shoot가 유기되었고 (Figure 2) 형질전환된 연초 식물체를 다수 획득하였다 (Kim et al. 1999). 인삼 CAB 유전자로 형질전환된 연초 2세대 식물체의 도입된 cab 유전자 존재여부를 primer를 사용한 genomic PCR 방법으로 조사하였으며 그 결과는 figure 3과 같다.
- 형질전환 연초 R2세대 식물체는 genomic PCR에 의해 CAB 유전자의 존재여부를 확인하였다. 식물체의 형질전환 여부는 재분화 식물체에서 정제한 genomic DNA를 template로 하고 인삼 CAB 유전자 염기서열에 따라 합성된 5'-primer (5'-tctagaaatggctgcttccacaat)와 3'-primer (5f- ggatccaattcacaaacaattcu)를 이용하여 PCR한 후 890 bp 크기의 DNA 단편이 합성되는지 여부로 확인하였다.
이론/모형
- 식물체의 광합성량은 Li-6400 Portable Photosynthesis system (Li-Cor Inc., Lincoln, NE)를 이용하여 CCh 교환율 (CO2-exchange rates, CER)을 측정하였다 식물체의 chloro phyll 함량은 식물체의 생엽을 95% ethanol에 4°C, 1주일 동안 충분히 추출하여 Porra 등 (Porra et 시 1989)의 방법을 사용하였다.
성능/효과
- CAB 유전자로 형질전환된 2세대 식물체가 자연광 조건과 90% 차광된 조건의 온실에서 각각 자란 연초 식물체를 광량을 다르게 주면서 광합성능 정도를 조사한 평균 결과 형질전환 식물체의 광합성능 정도는 정상 NC82와 유사하거나 약간 높은 경향이었으며, 광포화점은 형질전환 식물체나 정상 NC82 모두 500 Rmol m%-'로 유사하였다. 형질전환 2세대 연초 식물체 7계통 중 C7, Cll, C14 계통의 광합성능 정도가 조사된 모든 광량에서 NC82보다 높게 나타났으며 포장에서 최대에너지인 1, 500 “mol 에서도 약 40%정도 광합성 능이 높게 나타났다 (Figure 4).
- CAB 유전자로 형질전환된 2세대 식물체를 자연광 조건과 90% 차광된 온실에서 각각 생육시킨 결과 형질전환 식물체의 광합성능 정도는 정상 식물체와 유사하거나 약간 높은 경향이었으며, 광포화점은 형질전환 담배 식물체나 정상 식물체 모두 500/zmol m-2s-1로 차이가 없었다. 조사한 7계통 중 C7, CH, C14 계통의 광합성 정도가 조사된 모든 광량에서 정상 담배 식물체보다 높게 나타났다.
- R2세대 형질전환 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리의 생체중을 조사한 결과 형질전환 식물체 2세대 식물체의 생체중은 NC82에 비하여 작았으나 건물률은 높았으나 R3 세대에서는 역으로 생체중은 NC82와 유사하였으나 건물률은 낮게 나타났다 (Table 2). 이 결과로 광합성능의 제고가 생체중 혹은 건물률의 증가에 영향을 주지 않는 것으로 추즉된다.
- 5배, light harvesting complex II 함량은 2 〜3배 증가하였음을 보고하였다. 본 실험에서도 형질전환 식물체와 정상식물체 그리고 자연광 조건과 차광 조건 등에서 약간의 함량차이는 있었으나 유의성 있는 차이는 나타내지 않았다.
- 온실에서 생장한 형질전환 연초 식물체의 하위부터 7, 8, 9 매째를 수확하여 정상 건조하고 건물율을 각각 3반복으로 조사한 결과 형질전환 연초의 건물율은 정상담배 식물체와 비교하여 유의 차는 없었으며 (Table 3), 형질전환 연초와 정상 연초의 수확엽의 내용성분을 대표적으로 니코틴, 전당, 전 질소 함량을 조사한 결과는 table 4와 같으며 수확엽의 내용성분은 nicotine, 전당, 전질소 모두에서 개체별 차이는 다소 있었으나 유의차는 보이지 않았다. 추후 포장에서 하위엽의 생육 정도 및 생육특성 등을 조사하여야 할 것이며 하위엽과 상위엽의 내용성분 및 품질을 제고하는지 여부도 조사되어야 새로운 품종으로의 육성이 가능할 것이라 사료된다.
- R2세대 형질전환 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리의 생체중을 조사한 결과 형질전환 식물체 2세대 식물체의 생체중은 NC82에 비하여 작았으나 건물률은 높았으나 R3 세대에서는 역으로 생체중은 NC82와 유사하였으나 건물률은 낮게 나타났다 (Table 2). 이 결과로 광합성능의 제고가 생체중 혹은 건물률의 증가에 영향을 주지 않는 것으로 추즉된다.
- 인삼 CAB 유전자로 형질전환된 연초 2세대 식물체를 온실에서 자연광 조건과 90% 차광된 조건에서 각각 생육된 식물체의 광도별 광합성 정도를 각각 조사한 결과는 figure 5와 figure 6과 같으며 자연광 조건에서 생육한 7계통의 형질전환 식물체의 광합성 정도는 정상식물체에 비하여 약 20% 정도 광합성 능이 높았으며 특히 C7, Cll, C16 계통은 500 Nmol m-2s-1의 광도에서 정상식물체보다 각각 8%, 10%, 5% 높게 나타났으며, 조사된 500-1, 500 μmol m%'에서 전반적으로 광합성 능이 높게 나타났다 (Figure 5).
- CAB 유전자로 형질전환된 2세대 식물체를 자연광 조건과 90% 차광된 온실에서 각각 생육시킨 결과 형질전환 식물체의 광합성능 정도는 정상 식물체와 유사하거나 약간 높은 경향이었으며, 광포화점은 형질전환 담배 식물체나 정상 식물체 모두 500/zmol m-2s-1로 차이가 없었다. 조사한 7계통 중 C7, CH, C14 계통의 광합성 정도가 조사된 모든 광량에서 정상 담배 식물체보다 높게 나타났다. 차광된 조건에서 생육한 담배 식물체의 광합성능 정도는 조사된 7계통중 C2, Cll, C14 계통이 90% 차광된 온실조건에서도 광합성 능이 우수하게 나타났다.
- 조사한 7계통 중 C7, CH, C14 계통의 광합성 정도가 조사된 모든 광량에서 정상 담배 식물체보다 높게 나타났다. 차광된 조건에서 생육한 담배 식물체의 광합성능 정도는 조사된 7계통중 C2, Cll, C14 계통이 90% 차광된 온실조건에서도 광합성 능이 우수하게 나타났다.
- 차광된 조건에서 생육한 담배 식물체의 광합성능 정도를 조사한 결과 4계통의 형질전환 식물체는 정상식물체에 비하여 광합성능이 낮게 나타났으나 조사된 7계통중 C2, C11, C14 계통은 90% 차광된 온실조건에서도 광합성능이 우수하게 나타났으며 특히 C11 계통의 광합성능은 500μmol m%-' 의 광도에서 정상식물체보다 13% 높게 나타났다 (Figure 6).
- 포장에서 자연광의 차단 정도를 조사한 결과 연초의 상위부위에 비해 중엽 부위 및 하엽 부위는 각각 58%, 87% 차광 되었으며, 차광된 온실에서는 약 90% 차광되었다 (data not shown). R2세대 형질전환 유식물체의 잎, 줄기, 뿌리의 생체중을 조사한 결과 형질전환 식물체 2세대 식물체의 생체중은 NC82에 비하여 작았으나 건물률은 높았으나 R3 세대에서는 역으로 생체중은 NC82와 유사하였으나 건물률은 낮게 나타났다 (Table 2).
- 모두 500 Rmol m%-'로 유사하였다. 형질전환 2세대 연초 식물체 7계통 중 C7, Cll, C14 계통의 광합성능 정도가 조사된 모든 광량에서 NC82보다 높게 나타났으며 포장에서 최대에너지인 1, 500 “mol 에서도 약 40%정도 광합성 능이 높게 나타났다 (Figure 4).
- 유의성은 없었다. 형질전환 담배 식물체 수확엽의 건물률은 정상 식물체와 비교하여 차이점이 나타나지 않았으며, 내용 성분도 nicotine, 전당, 전질소에서 차이가 없었다.
- 형질전환 담배 식물체의 chlorophyll 함량은 정상 NC82와 차이가 없었으며, 양지에서 생육한 조건과 90% 차광된 조건 모두에서 차이점이 없었으며 광합성능과 chlorophyll 함량과의 유의성은 없었다. 형질전환 담배 식물체 수확엽의 건물률은 정상 식물체와 비교하여 차이점이 나타나지 않았으며, 내용 성분도 nicotine, 전당, 전질소에서 차이가 없었다.
- 형질전환 연초 식물체의 chlorophyll 함량을 조사한 결과 형질전환 연초식물체의 chlorophyll 함량은 정상 NC82와 차이가 없었으며, 또한 양지에서 생육한 조건과 90% 차광된 조건 모두에서 chlorophyll 함량의 차이는 없었다 (Table 1). 광합성능과 chlorophy II 함량과의 유의성 있는 차이도 발견되지 않았다.
후속연구
- Petit Havana SRI)를 형질전환시켜 광합성능 제고 효과가 입증된바 있다 (Millar and Kay 1996). 그러나 포장조건에서 원료엽으로서의 제반 특성을 유지하면서 물질생산이 증가한 담배로 실용화를 위해서는 형질전환 담배의 광합성 효율 변화, 광합성량, 엽록소 함량 등 생리학적 연구와 온실 및 포장조건에서의 생육특성 검정이 수행되어야 할 것이다.
- 유의차는 보이지 않았다. 추후 포장에서 하위엽의 생육 정도 및 생육특성 등을 조사하여야 할 것이며 하위엽과 상위엽의 내용성분 및 품질을 제고하는지 여부도 조사되어야 새로운 품종으로의 육성이 가능할 것이라 사료된다.
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