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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 유전자총을 이용한 형질전환 식물체 생산체계 확립을 위하여 헬륨가스 압력, 유전자총 발사횟수, gold particle 크기 및 발사체와의 거리 등의 최적 조건을 구명하고 이를 통해 생산된 형질전환 식물체의 효율적 선발을 위한 삼투압조절제의 전처리 효과를 검증하고자 수행되었다.
- 본 실험은 심비디움 원괴체 (PLB: protocorm-like bodies)를 재료로 유전자총을 이용한 효율적인 형질전환 조건을 확립하고자 수행되었다. 이 PLB 조직에 제초제저항성 유전자인 bar 유전자와 reporter 유전자인 gus를 포함하고 있는 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 유전자총으로 형질전환 하였다.
제안 방법
- 선발을 마친 PLB는 PPT가 첨가되지 않은 HCa배지로 옮겨 shoot 및 root를 유도하였다. 4주마다 계대배양을 실시하며 식물체가 5~7 cm 정도 자라면 기외상태에서 순화과정을 거친 후, 온실로 이식하였다. 상기과정에 사용된 배지 및 각 단계별 배양기간에 대해 요약하였다 (Table 1).
- 6 μm), target 거리 (6, 9 cm)그리고 헬륨가스 압력 (900, 1,100, 1,350 psi)을 달리하여 심비디움 형질전환에 적합한 적정 유전자총 조건을 구명하고자 하였다. Bombardment 실시 후, PLB를 PPT 5mg/l가 첨가된 HCa선발배지에 치상하여 3주마다 계대배양한 후, 6주 후에 PPT저항성 PLB 형성율을 조사하였다.
- Bombardment 후 6주가 경과하고 나서, PPT-저항성 PLB 생존율을 측정하고 다시 3주 뒤에 GUS 발색검정을 실시한다. 최종적으로 12주가 경과 할 때, 신초가 형성된 형질 전환 PLB 수를 측정한다.
- PCR 분석은 유전자의 도입여부를 확인하는데 효과적인 분석방법인데 본 실험에서는 bar 유전자 (552 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5'-TCAAATCTCGGTCGGRGACGGGCA-3', reverse primer로서 5'-ATGAGCCCAGAACGCCC-3'를 이용하여 pre-denaturation은 94℃에서 4분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 58℃에서 30초, extention은 72℃에서 50초 로 33 cycle로 수행하였으며, last extention은 72℃에서 10분간 반응시켜 DNA를 증폭하였다.
- PLB 증식을 위해 뿌리 및 신초를 제거한 PLB를 일정한 크기 (가로×세로 0.5 cm)로 자른 후, 심비디움 PLB 증식배지인 HCa 배지 (hyponex 3 g/l trypton 1.5 g/l, CaNO3 0.5 g/l, sucrose 20 g/l, activated charcoal 1 g/l, Plant agar 7.5 g/l, pH 5.2)에 치상 후 4주마다 계대배양을 실시하였다.
- Particle bombardment 실험은 2일전 심비디움 PLB를 0.5 cm의 크기로 잘라 HCa 기본배지의 정중앙부분에 직경 4 cm 크기로 PLB 절편체를 치상 후, Biolistic Particle Delivery System (PDS-1000/He, Bio-red, USA)을 사용하여 PLB에 bombarding하였다.
- 최근에는 Chin 등 (2007)에 의해 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법으로 hygromycin 선발배지에서 hygromycin 저항성을 나타내는 개체들을 선발하여 gus 발현까지 확인 하였다. 또한 이들 개체들로부터 gus 및 hpt 유전자 도입을 PCR 검정을 통해 확인하고, single copy 유전자가 들어간 개체생산을 Southern blot 검정으로 확인하였다.
- 형질전환 식물체 선발과정에서 선발배지에 첨가되는 항생제 및 제초제의 선발농도는 매우 중요한 요인이다. 본 실험에 선발약제로서 첨가되는 PPT (phosphinotricin)의 적정처리 농도를 알아보기 위해 HCa배지에 PPT를 0, 3, 5, 10, 15 mg/l을 각각 첨가 후, 배양 4주후에 신초발생 및 고사율을 조사하였다.
- 본 실험에서 유전자총을 이용하여 형질전환 심비디움 식물체를 생산하기 위한 적정조건을 확립하였으며, 이를 기반으로 PCR 분석을 통해 유전자 도입을 확인하고 추가적인 Basta 제초제처리를 통한 bar 저항성 유전자 발현 정도를 간접적으로 확인하였다. 이러한 체계를 바탕으로 bar나 gus 등의 선발이나 report 유전자 종류 이외의 바이러스 저항성이나 환경저항성 등 유용 유전자가 도입된 형질전환 심비디움 식물체 개발에 기여 할 수 있을 것으로 기대된다.
- 삼투압조절제 처리가 gus 유전자 일시발현 및 형질전환 효율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 4가지 처리구 (삼투압조절제 무처리, 0.2 M Mannitol, 0.2 M Sorbitol, 0.2 M Mannitol + 0.2 M Sorbitol 혼용처리)를 bombarding 하기 전에 위에서 기술한 4가지 처리구대로 배지에 첨가하여 4시간 동안 배양 후, bombardment를 수행하고 나서 삼투압 조절제가 포함되어 있지 않은 PPT 5 mg/l만 첨가된 HCa 선발배지에 3주간 배양한 후, 3주에 1회씩 계대배양을 수행하며 12주간 배양한다.
- 유전자를 gold particle에 코팅하기 위하여 pCAMBIA3301벡터로부터 HiYield™ Plasmid Mini kit (Real Biotech Corporation, Taiwan)를 이용하여, plasmid DNA를 추출하였다.
- 유전자총을 이용하여 형질전환 된 PLB는 PPT 5mg/l가 첨가된 HCa선발배지로 옮겨 4주마다 계대배양을 실시하며 12주간 선발하였다. 선발을 마친 PLB는 PPT가 첨가되지 않은 HCa배지로 옮겨 shoot 및 root를 유도하였다.
- 유전자총의 조건확립을 위하여 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 DNA 농도 (1.0, 2.0 μg/1회 bombardment), gold particle 크기 (0.6, 1.0 및 1.6 μm), target 거리 (6, 9 cm)그리고 헬륨가스 압력 (900, 1,100, 1,350 psi)을 달리하여 심비디움 형질전환에 적합한 적정 유전자총 조건을 구명하고자 하였다.
- 본 실험은 심비디움 원괴체 (PLB: protocorm-like bodies)를 재료로 유전자총을 이용한 효율적인 형질전환 조건을 확립하고자 수행되었다. 이 PLB 조직에 제초제저항성 유전자인 bar 유전자와 reporter 유전자인 gus를 포함하고 있는 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 유전자총으로 형질전환 하였다. 형질전환 벡터에 포함되어 있는 제초제저항성유전자 (bar)를 이용하여 선발하게 되므로 선발배지에 첨가될 제초제로서 PPT (Phosphinotricin)의 적정 농도를 찾고자 실험한 결과, 5 mg/l에서 최적의 대부분의 PLB의 생육이 억제되고 신초형성이 이루어지지 않았다.
- 이를 기반으로 유전자총 실험에 맞는 최적 조건을 찾는 실험을 수행하여 1.0 μm gold입자크기, 헬륨가스 압력은 1,100과 1,350 psi사이에서는 차이가 없다는 전제 하에 물리적 피해가 덜 가는 1,100 psi를 조건으로 선택하였고, 유전자총과 목표물과의 거리는 6 cm 그리고 DNA 농도는 1회 유전자총 발사횟수당 1.0 μg 조건을 최적조건으로 하였다.
- PCR 분석은 유전자의 도입여부를 확인하는데 효과적인 분석방법인데 본 실험에서는 bar 유전자 (552 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5'-TCAAATCTCGGTCGGRGACGGGCA-3', reverse primer로서 5'-ATGAGCCCAGAACGCCC-3'를 이용하여 pre-denaturation은 94℃에서 4분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 58℃에서 30초, extention은 72℃에서 50초 로 33 cycle로 수행하였으며, last extention은 72℃에서 10분간 반응시켜 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA 는 0.7% agarose gel에서 전기영동을 실시하여 목표 유전자의 도입여부를 확인하였다.
- 형질전환 심비디움 식물체에 도입된 bar 유전자의 발현을 확인하기 위하여 PPT선발을 거친 심비디움 형질전환 식물체의 엽을 절취한 후, Basta 용액 (0.5% v/v)에 처리하여 6일후에 갈변 및 고사를 관찰하였다.
대상 데이터
- 형질전환 추정 식물체의 PLB 및 shoot를 체취한 후, 막자사발과 액체질소를 이용하여 미세한 가루로 분쇄한 후 genomic DNA Extraction Mini kit.(Real Biotech Corporation, Taiwan)를 이용하여 DNA를 추출하였다. PCR 분석은 유전자의 도입여부를 확인하는데 효과적인 분석방법인데 본 실험에서는 bar 유전자 (552 bp)의 도입을 확인하기 위해 forward primer로서 5'-TCAAATCTCGGTCGGRGACGGGCA-3', reverse primer로서 5'-ATGAGCCCAGAACGCCC-3'를 이용하여 pre-denaturation은 94℃에서 4분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 58℃에서 30초, extention은 72℃에서 50초 로 33 cycle로 수행하였으며, last extention은 72℃에서 10분간 반응시켜 DNA를 증폭하였다.
- 예비실험에서 심비디움 4개 계통 중 융플라워⨉마사코 계통이 PLB 증식율도 우수하였고, 높은 신초형성율을 보여 형질전환 실험재료로 선택하였다 (데이터 미제시). 이 계통을 이용하여 선발약제의 적정농도를 선발하기 위한 PPT 처리실험을 수행한 결과, 5 mg/l의 PPT 처리조건에서 배양 4주후에 PLB 생육도 저하되고 PLB로부터 신초형성도 억제되는 현상을 관찰하여 PPT를 5 mg/l 첨가 시 형질전환 개체 선발에 효율적인 농도라고 사료되었다 (Fig.
- 유전자총을 이용한 실험에 사용된 벡터는 CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터와 nopaline synthase terminator 에 의해 조절되는 phosphinotricin (ppt) 유전자를 선발표지로 포함하고, gus 유전자를 reporter 마커로 포함하는 pCAMBIA3301 벡터 (CSIRO, Canberra, Australia)를 사용하였다.
- 형질전환 연구에 사용된 식물재료는 국립원예특작과학원 화훼과에서 분양받은 4가지 심비디움 계통(97-0773-93, 97-0773-107, 97-0773-300, 융플라워×마사코) 중 조직배양 반응성이 가장 우수하고 번식이 잘되는 융플라워×마사코 계통의 기내 PLB (protocorm-like-body)를 재료로 이용하였다.
이론/모형
- Bombarding 처리가 끝난 PLB 절편을 Jefferson 등 (1987)의 방법에 따라 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase (X-gluc) 용액에 침지하여 37℃에서 12시간 이상 반응 시킨 후, 70% 에탄올로 탈색시켜 GUS 발색여부와 정도를 관찰하였다.
성능/효과
- PCR 검정을 통해 유전자 도입이 확인된 형질전환 심비디움 식물체 5 계통들의 신초를 절취하여 Basta 0.5% (v/v)에 처리하여 3일 후에 저항성 양상을 조사한 결과, 5계통 중 3계통 (1번, 3번과 5번)들은 비형질전환 심비디움의 엽조직과 비교하여 Basta 제초제에 대한 저항성을 나타내었는데 특히 5번 계통은 최초 처리상태와 비슷한 정도의 녹색을 유지하여 강한 저항성을 보여 주었다. (Fig.
- 결론적으로 본 실험에서 “융플라워×마사코 심비디움 계통을 재료로 확립된 유전자총 조건과 삼투압 처리를 적용한 평균적인 형질전환 효율은 100개의 PLB를 유전자총을 이용하여 형질전환 수행하면, 최종적으로 온실까지 순화되는 형질전환 심비디움 개체수는 약 3.2 ~ 4.0개 정도가 생산되는 형질전환 효율이라고 할 수 있다.
- 6 μm와 비교하면 2배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었다. 또한, 헬륨가스 압력이 1,100 psi 그리고 유전자총과 목표 간의 거리가 6 cm인 경우에서 형질전환 효율이 가장 좋았다 (Table 2).
- 본 실험을 통해 생산된 형질전환 심비디움 개체들은 PCR 분석을 통해 유전자 도입을 확인하였고, 형질전환 개체 중 임의로 선발된 5계통들의 잎을 Basta 0.5% 용액에 침지한 결과, 3 계통은 제초제에 저항성을 가지는 것으로 확인되었고, 그 중 1계통은 아주 강한 저항성을 보여주었다. 본 실험 결과들을 바탕으로 환경저항성 등의 유용유전자가 도입된 형질전환 심비디움 식물체 개발에 기여하리라 사료된다.
- 본 연구에서도 0.2 M sorbitol과 0.2 M mannitol이 혼합하여 첨가된 처리구의 경우, 무처리구와 비교해서 2.7배 이상의 gus 발색율과 2.5배 향상된 형질전환 식물체 생산효율을 나타내었다 (Table 3). 삼투압조절제인 sorbitol과 mannitol이 0.
- 심비디움에서 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 PLB절편 체에 bombardment할 때의 적정 조건을 구명하고자 DNA 농도, 헬륨가스 압력, target 거리 및 gold 입자의 크기 등을 달리하여 처리한 결과, DNA 농도 1.0과 2.0 μg/ 1회 유전자총 발사횟수 그리고 gold particle의 직경 1.0과 1.6μm에서는 큰 차이를 보이지 않았다 (Table 2).
- 예비실험에서 심비디움 4개 계통 중 융플라워⨉마사코 계통이 PLB 증식율도 우수하였고, 높은 신초형성율을 보여 형질전환 실험재료로 선택하였다 (데이터 미제시). 이 계통을 이용하여 선발약제의 적정농도를 선발하기 위한 PPT 처리실험을 수행한 결과, 5 mg/l의 PPT 처리조건에서 배양 4주후에 PLB 생육도 저하되고 PLB로부터 신초형성도 억제되는 현상을 관찰하여 PPT를 5 mg/l 첨가 시 형질전환 개체 선발에 효율적인 농도라고 사료되었다 (Fig. 1). 본 연구와 동일한 pCAMBIA3301 벡터를 사용한 Lee 등 (2008)의 연구에서도 PPT 5 mg/l이 최적의 선발농도라고한 결과와 일치하였다.
- 0 μg 조건을 최적조건으로 하였다. 이 조건을 기반으로 100개의 PLB를 형질전환 하면 평균적으로 6~8개의 PLB가 제초제 저항성을 나타내는 개체로 성장하고 최종적으로 2개체 정도가 온실에서 순화과정을 거쳐 완전한 형질전환 식물체로 생산된다. 이외에도 유전자총 실험 전에 0.
- 이 조건을 기반으로 100개의 PLB를 형질전환 하면 평균적으로 6~8개의 PLB가 제초제 저항성을 나타내는 개체로 성장하고 최종적으로 2개체 정도가 온실에서 순화과정을 거쳐 완전한 형질전환 식물체로 생산된다. 이외에도 유전자총 실험 전에 0.2 M sorbitol과 0.2 M mannitol을 혼합 처리하여 4시간 동안 배양시키면 2배 이상 효율을 높일 수 있게 되어, 결론적으로 100개의 PLB를 형질전환 수행하면 최종적으로 3.2 ~ 4.0개 정도의 형질전환 심비디움 식물체가 나오는 효율이라고 할 수 있다.
- 이 PLB 조직에 제초제저항성 유전자인 bar 유전자와 reporter 유전자인 gus를 포함하고 있는 pCAMBIA3301 벡터를 이용하여 유전자총으로 형질전환 하였다. 형질전환 벡터에 포함되어 있는 제초제저항성유전자 (bar)를 이용하여 선발하게 되므로 선발배지에 첨가될 제초제로서 PPT (Phosphinotricin)의 적정 농도를 찾고자 실험한 결과, 5 mg/l에서 최적의 대부분의 PLB의 생육이 억제되고 신초형성이 이루어지지 않았다. 이를 기반으로 유전자총 실험에 맞는 최적 조건을 찾는 실험을 수행하여 1.
- 형질전환 실험에서 획득한 심비디움 형질전환 재분화체계통 중 8계통을 임의로 선발하여 PCR 분석을 한 결과, 8계통 모두 bar 유전자 도입을 확인하였다 (Fig. 3). 하지만 Gus 발색 반응이 나타난 계통임에도 불구하고 추가적으로 실시한 PCR 분석에서는 bar 유전자 도입이 확인이 되지 않은 경우가 있었는데 이는 유전자총에 의하여 온전하게 bar 유전자가 심비디움 genome내로 삽입되지 않았거나, 또는 온전히 삽입되었다 하더라도 gene silencing 이나 기타 신초재분화 과정에서 bar 유전자가 소실된 것으로 추정된다.
후속연구
- 2008). 따라서 보다 안정적이고 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위하여 아그로박테리움을 이용한 심비디움 형질전환 연구 또는 이 두가지 방법을 결합하여 적용하는 것도 고려해볼 수 있다고 사료된다.
- 5% 용액에 침지한 결과, 3 계통은 제초제에 저항성을 가지는 것으로 확인되었고, 그 중 1계통은 아주 강한 저항성을 보여주었다. 본 실험 결과들을 바탕으로 환경저항성 등의 유용유전자가 도입된 형질전환 심비디움 식물체 개발에 기여하리라 사료된다.
- 형질전환 난과식물체 생산 연구에 있어서 덴드로비움 (Kuehnle and Sugii 1992)을 시작으로 많은 연구가 보고되었지만, 심비디움 식물에서는 1992년 이후로 3~4편 내외의 소수에 불과한 실정이다. 이러한 어려움에도 불구하고 적합한 선발약제와 선발과정 개선, 유전자총 조건 확립, 아그로박테리움 접종 및 공동배양 조건확립, acetosyringone 및 삼투압조절제 등의 첨가 등 다양한 분야에서의 개선을 통한 고효율의 형질전환 체계가 확립된다면 형질전환 심비디움 식물체가 대량 생산되는 시스템 개발도 가능할 것이다.
- 본 실험에서 유전자총을 이용하여 형질전환 심비디움 식물체를 생산하기 위한 적정조건을 확립하였으며, 이를 기반으로 PCR 분석을 통해 유전자 도입을 확인하고 추가적인 Basta 제초제처리를 통한 bar 저항성 유전자 발현 정도를 간접적으로 확인하였다. 이러한 체계를 바탕으로 bar나 gus 등의 선발이나 report 유전자 종류 이외의 바이러스 저항성이나 환경저항성 등 유용 유전자가 도입된 형질전환 심비디움 식물체 개발에 기여 할 수 있을 것으로 기대된다.
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