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문제 정의
- 따라서 본 연구는 배추 무름병 발병을 효과적으로 억제할 수 있는 미생물을 분리, 선발하여 특성을 검정하고 포장에서의 미생물 처리방법, 생물적 방제 효과 등에 대한 결과를 얻기 위하여 실시하였다.
- (기탁번호 KACC92027)로 기탁하였고, 배추 무름병 방제제 Bacillus sp.로 특허등록(제10-1765304) 하였으나 본 논문을 통하여 B. toyonensis로 명명하고자 한다(Fig. 2). B.
- 무름병 억제 미생물은 병원균에 대한 항세균 활성과 함께 무름병의 발병 기작을 억제할 수 있는 균주의 선발을 목표로 수행하였다. Pectate lyase는 식물 병원균이 체외로 분비하는 병원성 결정인자이며, 이 효소의 생산 여부와 양에 따라 병원성의 강약에 차이가 있는 것으로 알려져 있다(Zucker et al.
제안 방법
- 일본에서는 박테리오신(bacteriocin)을 생성하는 비병원성 Erwinia carotovora subsp. carotovora 돌연변이 균주를 이용하여 화학 약제와 유사한 방제 효과를 확인하였다(Kyeremeh et al., 2000). 우리나라에서도 비병원성 E.
- 배추의 정식 거리는 30×30 ㎝이며 3반복으로 반복 별 50주를 정식하고, 발병율은 병원균 접종 30일 후 발병주율로 조사하였다.
- 선발 미생물을 계통분석을 하기 위해 27f와 1492r primer (Frank 등, 2008)를 이용하여 rDNA 16S 유전자 영역을 증폭하였다. 분석된 염기서열(1,429 bp)은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 염기서열을 비교 분석하였으며, Bacillus 속 다른 종의 염기서열과 함께 Tamura 등(2013)이 개발한 Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.
- 정식 20일 된 배추의 중륵에 철브러쉬를 이용하여 3 ㎝ 길이로 상처를 내고 NB 배지에서 72시간 배양한 배추 무름병균을 108 cells/㎖ 농도로 멸균수와 함께 희석하여 5 ㎖ 분무접종 하였다. 선발된 억제 미생물은 107 cells/㎖ 농도로 희석하여 배추 1주당 200 ㎖씩 10일 간격 3회 엽면 살포하였고, 억제미생물과 병원균 접종 전후처리의 간격은 24시간으로 하였다. 대조약제로는 옥솔린산 수화제(1,000 ppm)를 엽면살포 하였다.
- 시험 품종은 봄배추 품종 ‘노랑봄’과 가을배추 품종 ‘불암 3호’를 이용하였고, 봄배추에서는 병원균 감염 전후 미생물 처리시기에 따른 방제 효과를, 가을배추에서는 봄배추에서 우수한 효과를 보인 처리방법을 선택하여 다시 한 번 검정하였다.
- 생물적 방제 효과를 검정하기 위하여 충청남도농업기술원 내 시설포장(330 ㎡)을 이용하였다. 정식 20일 된 배추의 중륵에 철브러쉬를 이용하여 3 ㎝ 길이로 상처를 내고 NB 배지에서 72시간 배양한 배추 무름병균을 108 cells/㎖ 농도로 멸균수와 함께 희석하여 5 ㎖ 분무접종 하였다. 선발된 억제 미생물은 107 cells/㎖ 농도로 희석하여 배추 1주당 200 ㎖씩 10일 간격 3회 엽면 살포하였고, 억제미생물과 병원균 접종 전후처리의 간격은 24시간으로 하였다.
대상 데이터
- 선발된 억제 미생물은 107 cells/㎖ 농도로 희석하여 배추 1주당 200 ㎖씩 10일 간격 3회 엽면 살포하였고, 억제미생물과 병원균 접종 전후처리의 간격은 24시간으로 하였다. 대조약제로는 옥솔린산 수화제(1,000 ppm)를 엽면살포 하였다. 배추의 정식 거리는 30×30 ㎝이며 3반복으로 반복 별 50주를 정식하고, 발병율은 병원균 접종 30일 후 발병주율로 조사하였다.
- 무름병 억제 미생물의 분리를 위해 토양 시료는 야산 부엽토, 식물체의 근권토양 등을 채집하여 사용하였고, NA (nutrient agar) 배지에서 희석평판법에 의하여 분리하였으며 분리된 미생물은 배추 무름병균과 대치 배양에 의한 길항력 정도로 1차 선발하였다. 1차 선발된 미생물은 NB (nutrient broth)배지에서 약 48~72시간 배양한 후 원심분리하여 얻어진 배양여액을 membrane filter (pore size 0.
- 2㎕)로 여과하였다. 배양여액은 PYA (polygalacturonic acid 1%, yeast ext. 1%, phenol red 0.001%, agar 1.5%)배지에 200 ㎕를 도말한 후 배지 중앙에 배추 무름병균을 흡착시킨 paper disc를 올려놓고 27℃에서 약 48~72시간 배양한 후 4N HCl로 배지를 세척하여 clear zone이 형성되지 않는 균주를 무름병 억제 미생물로 최종 선발하였다.
- 생물적 방제 효과를 검정하기 위하여 충청남도농업기술원 내 시설포장(330 ㎡)을 이용하였다. 정식 20일 된 배추의 중륵에 철브러쉬를 이용하여 3 ㎝ 길이로 상처를 내고 NB 배지에서 72시간 배양한 배추 무름병균을 108 cells/㎖ 농도로 멸균수와 함께 희석하여 5 ㎖ 분무접종 하였다.
- 1A), 이 clear zone 형성을 억제하는 균주는 배추 무름병의 발병기작을 억제하는 것으로 판단하였다. 선발된 CAB12243-2 균주는 배양여액을 PYA 배지에 도말한 후 무름병균을 배양해도 pectin 분해 활성이 완전하게 억제되는 것을 확인하였고(Fig. 1B), 이 균주를 배추 무름병의 생물적 방제 효과 검정에 사용하였다.
데이터처리
- e Values designated by the same letter are not significantly different by Duncan’s multiple range test (P≤0.05).
- 선발 미생물을 계통분석을 하기 위해 27f와 1492r primer (Frank 등, 2008)를 이용하여 rDNA 16S 유전자 영역을 증폭하였다. 분석된 염기서열(1,429 bp)은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 염기서열을 비교 분석하였으며, Bacillus 속 다른 종의 염기서열과 함께 Tamura 등(2013)이 개발한 Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 프로그램을 사용하여 phylogenetic tree를 작성하였다. 또한, Hildebrand 등(1988)의 방법으로 mineral salt agar에서 arabinose, glucose, mannitol, pratinose, rhamnose, sucrose 및 trehalose 등에 대한 당 이용성을 조사하였다.
이론/모형
- The phylogenetic tree was generated using the neighbor-joining method. Bootstrap values, expressed as percentages of 1,000 replications, are given at branching points.
- 또한, Hildebrand 등(1988)의 방법으로 mineral salt agar에서 arabinose, glucose, mannitol, pratinose, rhamnose, sucrose 및 trehalose 등에 대한 당 이용성을 조사하였다.
성능/효과
- 6%와 유의적인 차이가 없기 때문에 경제적으로 접종 후 처리가 병 방제에 유리할 것으로 판단되었다(Table 2). 가을배추인 불암 3호 배추 시험에서는 병원균 접종 후처리만으로 검정을 수행하였으며 이때의 방제 효과는 68.9%로 매우 우수하였다(Table 3). 배추 무름병의 생물적 방제 연구 결과로 Shrestha 등(2009)과 Tsuda 등(2016)은 Lactobacillus 균주를 선발하여 55~62%의 포장 방제효과를 확인하였다.
- toyonensis CAB12243-2에 다양한 제형화 기술이 개발되었을 경우 배추의 생육기 중 엽면살포 뿐만 아니라 정식 전 토양혼화 처리 등 다양한 방법으로 배추 무름병의 방제 효과는 높아질 것으로 판단된다. 그리고 봄배추와 가을배추의 방제 효과 검정에서 무처리 발병율은 각각 88.9%와 26.7%로 매우 큰 차이가 있었다. 이것은 재배환경에 의한 것으로 봄배추 시기에는 낮은 외부 온도로 인하여 시설 내의 환기가 거의 이루어지지 않고, 배추의 빠른 생육을 목적으로 관수가 과하게 이루어져 효과적인 무름병의 발병환경이 조성되었기 때문이다.
- toyonensis CAB12243-2를 엽면 살포한 모든 처리구에서 무름병징은 억제되어 표면이 건조하게 되고 발병이 정지된 것을 확인하였다(Fig 3C). 노랑봄 배추와 불암 3호 배추에 무름병균을 노랑봄 배추에서는 병원균 접종 전후 처리 시 가장 높은 73%의 방제 효과를 보였으나 병원균 접종 후처리 시의 방제가 61.6%와 유의적인 차이가 없기 때문에 경제적으로 접종 후 처리가 병 방제에 유리할 것으로 판단되었다(Table 2). 가을배추인 불암 3호 배추 시험에서는 병원균 접종 후처리만으로 검정을 수행하였으며 이때의 방제 효과는 68.
- 이것은 재배환경에 의한 것으로 봄배추 시기에는 낮은 외부 온도로 인하여 시설 내의 환기가 거의 이루어지지 않고, 배추의 빠른 생육을 목적으로 관수가 과하게 이루어져 효과적인 무름병의 발병환경이 조성되었기 때문이다. 따라서 B. toyonensis CAB12243-2와 같은 길항미생물의 살포와 함께, 시기별 재배환경의 조절이 이루어지면 방제 효과는 향상될 것이며, 또한 B. toyonensis CAB12243-2 균주가 실용화 되었을 경우 유기농 배추 재배농가의 무름병 뿐만 아니라 저장 중 또는 유통 중에 발생하는 P. carotovorum subsp. carotovorum에 의한 많은 채소류의 무름병 방제에도 광범위하게 적용되어 현재 화학농약만으로 형성된 배추 무름병 시장을 생물농약으로 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
- , 1998). 따라서 배추 무름병균의 pectate lyase 활성은 PYA 배지에서 배양하였을 때 clear zone 형성으로 확인 가능하기 때문에(Fig. 1A), 이 clear zone 형성을 억제하는 균주는 배추 무름병의 발병기작을 억제하는 것으로 판단하였다. 선발된 CAB12243-2 균주는 배양여액을 PYA 배지에 도말한 후 무름병균을 배양해도 pectin 분해 활성이 완전하게 억제되는 것을 확인하였고(Fig.
- 또한 이 균주는 ‘노랑봄’ 품종으로 봄배추 재배 시 73%, ‘불암3호’ 품종으로 가을배추 재배 시 68.9%의 포장 방제 효과를 보였다.
- 배추 무름병의 생물적 방제 연구 결과로 Shrestha 등(2009)과 Tsuda 등(2016)은 Lactobacillus 균주를 선발하여 55~62%의 포장 방제효과를 확인하였다. 본 연구에서는 B. toyonensis CAB12243-2 균주가 최대 68.9~73%의 무름병 방제 효과를 보여주었는데, 이러한 방제 효과의 차이는 Bacillus 균주가 포자를 형성하기 때문에 배추 포장에 살포된 이후 환경 변화에 내성을 가지며 장기간 생존하며 적응하였기 때문인 것으로 생각된다. 또 다른 연구로 Kyeremeh 등(2000)은 비병원성 Erwinia carotovora subsp.
- 선발된 CAB12243-2 균주의 16S rRNA gene 염기서열(1,429bp)은 NCBI의 GenBank에 등록(등록번호 MG256760)하였고, 계통학적 위치로 확인한 결과 Bacillus toyonensis (CP006863)의 16S rRNA 염기서열과 99% 상동성을 보였다. 이 균주는 특허출원 시 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 Bacillus sp.
- 9%의 포장 방제 효과를 보였다. 이러한 결과로 B. toyonensis CAB12243-2 균주는 채소류의 무름병에 대한 효과적인 생물적 방제제로 활용이 가능한 것을 확인할 수 있었다.
- 5였다(Table 1). 이러한 생육 특성으로 선발 균주가 산업화를 위한 대량 배양 시 저렴한 비용으로 생산이 가능한 유리한 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- carotovorum은 배추를 포함한 대부분의 채소작물에 강한 병원성을 나타낸다. 포장 방제 효과 검정을 통하여 배추 무름병 억제인자로 선발된 CAB12243-2 균주는 16S rRNA gene의 염기서열 상동성 분석으로 Bacillus toyonensis로 확인되었다. B.
- 무름병균을 노랑봄 배추와 불암3호 배추에 접종하면 중륵 하단부터 무름증상이 나타나고 위쪽으로 진전된다(Fig 3A, 3B). 하지만 B. toyonensis CAB12243-2를 엽면 살포한 모든 처리구에서 무름병징은 억제되어 표면이 건조하게 되고 발병이 정지된 것을 확인하였다(Fig 3C). 노랑봄 배추와 불암 3호 배추에 무름병균을 노랑봄 배추에서는 병원균 접종 전후 처리 시 가장 높은 73%의 방제 효과를 보였으나 병원균 접종 후처리 시의 방제가 61.
후속연구
- carotovorum subsp. carotovorum에 의한 많은 채소류의 무름병 방제에도 광범위하게 적용되어 현재 화학농약만으로 형성된 배추 무름병 시장을 생물농약으로 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이번 연구의 결과는 앞으로 B. toyonensis CAB12243-2에 다양한 제형화 기술이 개발되었을 경우 배추의 생육기 중 엽면살포 뿐만 아니라 정식 전 토양혼화 처리 등 다양한 방법으로 배추 무름병의 방제 효과는 높아질 것으로 판단된다. 그리고 봄배추와 가을배추의 방제 효과 검정에서 무처리 발병율은 각각 88.
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