[국내논문]담배 (Nicotiana tabacum cv. BY4)의 캘러스로부터 p-Fluorophenylalanine 저항성 캘러스 선발 및 효소활성도 측정 p-Fluorophenylalanine Resistant Cell Line Selection and Enzyme Activity from Diploid and Hapliod calli of Nicotiana tabacum cv. BY4원문보기
Calli were induced on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D by using the leaf explants of haploid which were derived from the diploid and haploid of Nicotiana tabacum cv BY4. These calli were subcultured on MS medium with the combination of 2.0 mg/L 2,4-D, 1.0 mg/L kinetin and 0.1 mg/L BAP. Cel...
Calli were induced on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D by using the leaf explants of haploid which were derived from the diploid and haploid of Nicotiana tabacum cv BY4. These calli were subcultured on MS medium with the combination of 2.0 mg/L 2,4-D, 1.0 mg/L kinetin and 0.1 mg/L BAP. Cell propagation of diploid plants were good in a combination of 2.0 mg/L 2,4-D, 0.1mg/L BAP in vitro conditions, suspension cultures were conducted in equal condition. Homogenized suspension cultured cells were smeared 2.0 mL each on MS medium with 0~100 $\mu$M PFP, to select the resistant colony to PFP, and were examined after 10d, 20d and 30d. Measurment of fresh weight of cells after 30d of culture shows that with more concentration of PFP in medium the fresh weight of the cells decreased. In case of diploid, selected callus was the highest in vitro treated with 5 $\mu$M PFP. It was higher than control until 100 $\mu$M PFP. The active degree of catalase was the highest in vitro with 5 $\mu$M PFP but the lowest in vitro with 10 $\mu$M PFP on the other hand, in case of haploid plant, the active degree of peroxidase and catalase was the highest in vitro treated with 50 $\mu$M PFP. It's sure that enzyme active degree of between diploid and haploid had big differences.
Calli were induced on MS medium supplemented with 0.5 mg/L 2,4-D by using the leaf explants of haploid which were derived from the diploid and haploid of Nicotiana tabacum cv BY4. These calli were subcultured on MS medium with the combination of 2.0 mg/L 2,4-D, 1.0 mg/L kinetin and 0.1 mg/L BAP. Cell propagation of diploid plants were good in a combination of 2.0 mg/L 2,4-D, 0.1mg/L BAP in vitro conditions, suspension cultures were conducted in equal condition. Homogenized suspension cultured cells were smeared 2.0 mL each on MS medium with 0~100 $\mu$M PFP, to select the resistant colony to PFP, and were examined after 10d, 20d and 30d. Measurment of fresh weight of cells after 30d of culture shows that with more concentration of PFP in medium the fresh weight of the cells decreased. In case of diploid, selected callus was the highest in vitro treated with 5 $\mu$M PFP. It was higher than control until 100 $\mu$M PFP. The active degree of catalase was the highest in vitro with 5 $\mu$M PFP but the lowest in vitro with 10 $\mu$M PFP on the other hand, in case of haploid plant, the active degree of peroxidase and catalase was the highest in vitro treated with 50 $\mu$M PFP. It's sure that enzyme active degree of between diploid and haploid had big differences.
본 실험에서는 담배 (Nicotiana tabacum cv. BY4)5] 반수체와 이배체로부터 유도된 캘러스와 돌연변이 유발원으로 사용 중인 PFP를 처리하여 형성된 저항성 세포주를 선발하였고, 정상직인 반수체와 이배체의 캘러스와 PFP 저항성 세포주에 있어서 이들 세포주의 peroxidase와 catalase의 효소활성도를 조사하였다.
유도된 반수체 캘러스로부터 식물의 재생, 증식, 검정은 Oh 등(1994)의 방법에 준하여 실시하였다. 캘러스 유도는 MS 기본배지에 sucrose 30 g/L, agar 8 g/L를 첨가하고 생장 조절물질은 2, 4-D (0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/L)처리를 하였으며 pH 5.8로 맞춘 배지에 잎절편을 치상하여 온도 25±1℃, 조도 1900 lux, 광주기는 16/8 h의 조건에서 캘러스를 유도하였다. 캘러스의 증식은 2, 4-D와 BAP, 카이네틴이 첨가된 배지에서 실시하였다.
세포는 온도에 대한 스트레스를 적게 받도록 배지가 충분히 식은 후 무균적으로 첨가하였다. 선발배지는 2.0 mg/L 2, 4-D와 0.1 mg/L BAP가 첨가된 MS배 지에 PFP를 0~ 200〃M로 첨가하여 pH를 맞춘 후 습열멸균 하여 1회용 페트리디쉬에 25mL씩 분주하였다. 평판배양에 사용한 재료는 현탁배양 15~20일 후 세포증식이 양호한 처리구를 선발하여 65~ 100㎛망에 이중여과된 세포를 사용하였다.
8% agarose를 이용하여 PFP (Palmer and Widholm, 1975)가 0 ~ 100 段!의 농도로 처리 된 선발배지에 2mL씩 평판배양하였다. 평판배양 후 10, 20, 30일 단위로 선발배지에서 형성되는 PFP 저항성 세포주라 사료되는 colony 를 선발, 관찰하였다.
PFP에 대한 저항성 세포주를 선발하여 peroxidase 및 catalase 등의 효소활성도를 측정하였다. 재료는 생중량 1 g을 eppendorf tube에 넣고 완충 용액을 1.
PFP 50 jiiM처리구에는 배양 20일째 부터 colony가 출현되었으나 PFP 100μM 처리구에는 그보다 낮은 경향으로 배양 20일째가 되면서 페트리디쉬당 65~70개의 colony가 형성되었고, 그 이 후로도 숫자는 일정하게 유지가 되었다. PFP 200 pM 처리구에 있어서는 colony가 전혀 나타나지 않았으므로 본 실험에 있어서의 MIC의 설정은 PFP 100 理 처리구로 설정하였다(Figure 1A—F).
1 mg/L BAP 조합처리구에서 세포증식이 양호하였으므 로, 현탁배양도 동일조건에서 실시하였다. 세포괴를 균일하게 한 현탁배양세포를 p-Fluorophenylalanine (PFP) 이 5~100 阪의 농도로 단독처리한 배지상에 2.0 mL씩 평판배양하여, 10, 20, 30일 후 PFP의 처리에 대한 저항성 colony를 조사하였다. 배양 30일 후 세포주의 생중량을 측정한 결과 PFP의 농도가 높아질수록 감소하였다.
대상 데이터
한국인삼연초연구원 내 온실에서 유지되고 있는 담배(Nicotiana tabacum cv. BY4)의 이배체 식불과 약배양으로부터 유도된 반수체식물의 잎절편을 캘러스 유도 재료로 하였다. 유도된 반수체 캘러스로부터 식물의 재생, 증식, 검정은 Oh 등(1994)의 방법에 준하여 실시하였다.
8로 맞춘 배지에 잎절편을 치상하여 온도 25±1℃, 조도 1900 lux, 광주기는 16/8 h의 조건에서 캘러스를 유도하였다. 캘러스의 증식은 2, 4-D와 BAP, 카이네틴이 첨가된 배지에서 실시하였다. 현탁배양은 캘러스를 1,000㎛망에 통과시킨 후 식물생장 조절물질은 계대배양과 같은 동일조건으로 이루어졌으며, 배양조건으로는 shaking incubator에서 25 rpm, 온도 25±1℃ 로 하였다.
1 mg/L BAP가 첨가된 MS배 지에 PFP를 0~ 200〃M로 첨가하여 pH를 맞춘 후 습열멸균 하여 1회용 페트리디쉬에 25mL씩 분주하였다. 평판배양에 사용한 재료는 현탁배양 15~20일 후 세포증식이 양호한 처리구를 선발하여 65~ 100㎛망에 이중여과된 세포를 사용하였다. 그리고 이 세포를 0.
담배 (Nicotiana tabacum cv. BY4)의 이배체 식물과 약배양으로부터 유도된 반수체 식물의 잎절편을 사용하여 0.5 mg/L 2.4-D 단독처리구에서 캘러스를 유도한 후, 2.0 mg/L2.4-D, 1.0 mg/L Kinetin 및 0.1 mg/L BAP> 조합처리하여 계대배양을 하였다. 이배체에서는 2.
이론/모형
BY4)의 이배체 식불과 약배양으로부터 유도된 반수체식물의 잎절편을 캘러스 유도 재료로 하였다. 유도된 반수체 캘러스로부터 식물의 재생, 증식, 검정은 Oh 등(1994)의 방법에 준하여 실시하였다. 캘러스 유도는 MS 기본배지에 sucrose 30 g/L, agar 8 g/L를 첨가하고 생장 조절물질은 2, 4-D (0.
4 mL 가한 후 4℃에서 유리봉으로 마쇄한 다음 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 효소액으로 사용하였다. 효소 활성도의 측정은 효소반응액 의 흡광도를 spectrophotometer (Beckman DU-6)로 측정하였다. Peroxidase (EC 1.
효소 활성도의 측정은 효소반응액 의 흡광도를 spectrophotometer (Beckman DU-6)로 측정하였다. Peroxidase (EC 1.11.1.7)의 활성도는 Chance와 Maehly (1955)의 방법에 준하여 측정하였으며, Catalase (EC LI 1.1.6)는 Yang (1985) 등이 제시한 Decoupling 방법으로 측정하였다.
성능/효과
PFP 10/M 처리구에서도 PFP 5 μM 처리구와 마찬가지로 큰 차이는 없었고 PFP25〃M 처리구에서는 배양 10일째가 되면서 페트리디쉬당 최소 20개 정도 형성되었고 배양 20일 째 이후로는 colony의 출현빈도가 양호하였다. PFP 50 jiiM처리구에는 배양 20일째 부터 colony가 출현되었으나 PFP 100μM 처리구에는 그보다 낮은 경향으로 배양 20일째가 되면서 페트리디쉬당 65~70개의 colony가 형성되었고, 그 이 후로도 숫자는 일정하게 유지가 되었다. PFP 200 pM 처리구에 있어서는 colony가 전혀 나타나지 않았으므로 본 실험에 있어서의 MIC의 설정은 PFP 100 理 처리구로 설정하였다(Figure 1A—F).
배양세포에 처리된 PFP 농도가 증가할수록 형성되는 colony의 크기, 형성빈도, 캘러스 증식은 대조구보다는 저조한 생장률을 나타내었다. 그리고 PFP 단독처리시 설정한 최하저해농도는 이배체와 반수체 간에 100 및 50μM로 뚜 렷한 차이를 나타냈다.
배양세포에 처리된 PFP 농도가 증가할수록 형성되는 colony의 크기, 형성빈도, 캘러스 증식은 대조구보다는 저조한 생장률을 나타내었다. 그리고 PFP 단독처리시 설정한 최하저해농도는 이배체와 반수체 간에 100 및 50μM로 뚜 렷한 차이를 나타냈다. 반수체 식물이 이배체 식물보다 더 저 조하였고, 이배체 식물에서는 생중량이 점차 감소하였는데 반수체는 그 차이가 심하였다.
(Gatherdole and Street 1976; Berlin and Widholm 1977). PAL의 활성도는 PFP에 민감하거나 저항성을 띈 담배캘러스와 phenylala- nine을 과다하게 합성하는 담배캘러스에서 측정하였을 때 PFP의 저항성 담배캘러스는 PFP에 민감성을 나타내어 죽는 것보다 PAL의 활성도가 10~20배 높음을 알 수 있었으며, 계속된 배양에도 증가현상을 보였다. 또한 Acer pseudopla- 切ns에서 PFP 저항성 세포주를 선발하여 PAL의 활성도가 높아짐을 알 수 있었다 (Gatherole and Street 1976).
또한 Acer pseudopla- 切ns에서 PFP 저항성 세포주를 선발하여 PAL의 활성도가 높아짐을 알 수 있었다 (Gatherole and Street 1976). 본 실험 결과 PAL의 활성과 관계가 있으며 페놀화합물과 IAA의 함량을 조절하는 peroxidase와 중금속과 같은 독성의 해독에도 관 련이 있는 catalase의 활성도를 조사한 결과 각 처리구에 있어서 효소활성도는 대조구에 비해서 높은 활성도를 나타내었으며 (Somashekaraiah et al. 1992), 이배체와 반수체 간에도차이가 있었다. 이러한 실험결과 반수체를 이용하는 것이 돌연변이 선발에 효과적임을 알 수 있었다.
1992), 이배체와 반수체 간에도차이가 있었다. 이러한 실험결과 반수체를 이용하는 것이 돌연변이 선발에 효과적임을 알 수 있었다. 또한 아미노산 유사체를 사용하여 선발된 세포주는 식물체내의 높은 효소활성도 를 발현하므로 이를 사용하여 2차 대사산물 생산의 효율을 증가시킬 수 있다.
후속연구
또한 아미노산 유사체를 사용하여 선발된 세포주는 식물체내의 높은 효소활성도 를 발현하므로 이를 사용하여 2차 대사산물 생산의 효율을 증가시킬 수 있다. 그밖에도 공업지대와 같은 오염지역, 간척 지와 같은 불량토양, 그리고 제초제 저항성에 대한 연구 등과 같은 여러 분야에 폭넓게 응용되리라 사료된다.
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