우리나라 포도원에서 가장 많이 발생하여 피해를 주고 있는 grapevine leafroll-associated 3 Closterovirus (GLRaV-3)를 대상으로 기내 배양묘를 이용한 바이러스 순화 및 진단효율성을 검토하였다. 바이러스 감염주의 절간을 기내배양하여 증식시킨 기내 배양묘를 1개월 간격으로 계대배양하면서 배양묘를 ELISA 검정한 결과 고농도의 바이러스가 검출되었으며 배양묘의 부위별로 잎, 줄기 및 줄기 유래의 callus 조직에서 모두 고농도로 검출되었다. 또한 포장에서 재배되고 있는 포도나무의 잎이나 엽병조직에 비해 기내 배양묘의 조직을 사용하였을 때 높은 농도의 정제 바이러스를 얻을 수 있었으며, 전자현미경에 의한 dip 검경에서도 사상형 바이러스 입자가 관찰되었다. RT-PCR 진단에서는 기내 배양묘 조직을 사용하였을 때 포도 유엽조직과 엽병+중륵조직에 비해 검출효율이 높았다. 기내 배양묘의 잎조직을 이용하여 ELISA와 RT-PCR 검정감도를 비교한 결과 ELISA에 비해 RT-PCR 검정이 약 1,000배 감도가 높았다.
우리나라 포도원에서 가장 많이 발생하여 피해를 주고 있는 grapevine leafroll-associated 3 Closterovirus (GLRaV-3)를 대상으로 기내 배양묘를 이용한 바이러스 순화 및 진단효율성을 검토하였다. 바이러스 감염주의 절간을 기내배양하여 증식시킨 기내 배양묘를 1개월 간격으로 계대배양하면서 배양묘를 ELISA 검정한 결과 고농도의 바이러스가 검출되었으며 배양묘의 부위별로 잎, 줄기 및 줄기 유래의 callus 조직에서 모두 고농도로 검출되었다. 또한 포장에서 재배되고 있는 포도나무의 잎이나 엽병조직에 비해 기내 배양묘의 조직을 사용하였을 때 높은 농도의 정제 바이러스를 얻을 수 있었으며, 전자현미경에 의한 dip 검경에서도 사상형 바이러스 입자가 관찰되었다. RT-PCR 진단에서는 기내 배양묘 조직을 사용하였을 때 포도 유엽조직과 엽병+중륵조직에 비해 검출효율이 높았다. 기내 배양묘의 잎조직을 이용하여 ELISA와 RT-PCR 검정감도를 비교한 결과 ELISA에 비해 RT-PCR 검정이 약 1,000배 감도가 높았다.
Grapevine leafroll-associated 3 closterovirus (GLRaV-3) is phloem limited virus, and one of the most severe viral diseases found in Korea. However, nonhomogenous distribution and low concentration and seasonal variations of GLRaV-3 in grapevines remain as main problems which prevent the introduction...
Grapevine leafroll-associated 3 closterovirus (GLRaV-3) is phloem limited virus, and one of the most severe viral diseases found in Korea. However, nonhomogenous distribution and low concentration and seasonal variations of GLRaV-3 in grapevines remain as main problems which prevent the introduction and molecular biology or serology experiments. Virus-infected plantlet in vitro was obtained from node tissue cuttings, which was GLRaV-3 infected 'kyoho' vines. The amount of purified virus was highest in vitro plantlet. Moreover, viruses seem to be relatively homogeneously distributed in all organs including leaf, stem and callus derived from in vitro plantlets. RT-PCR detection using in vitro plantlet tissue as template was most effective. When comparing ELISA to RT-PCR, RT-PCR detection was 1,000 times as effective as ELISA. These results can be explained by improved quality such as tenderness or less tannins in plantlet in vitro. In conclusion, until infected herbaceous host will be available, tissue culture can be usefully adopted as a technique for a good source of GLRaV-3 closterovirus for further studies.
Grapevine leafroll-associated 3 closterovirus (GLRaV-3) is phloem limited virus, and one of the most severe viral diseases found in Korea. However, nonhomogenous distribution and low concentration and seasonal variations of GLRaV-3 in grapevines remain as main problems which prevent the introduction and molecular biology or serology experiments. Virus-infected plantlet in vitro was obtained from node tissue cuttings, which was GLRaV-3 infected 'kyoho' vines. The amount of purified virus was highest in vitro plantlet. Moreover, viruses seem to be relatively homogeneously distributed in all organs including leaf, stem and callus derived from in vitro plantlets. RT-PCR detection using in vitro plantlet tissue as template was most effective. When comparing ELISA to RT-PCR, RT-PCR detection was 1,000 times as effective as ELISA. These results can be explained by improved quality such as tenderness or less tannins in plantlet in vitro. In conclusion, until infected herbaceous host will be available, tissue culture can be usefully adopted as a technique for a good source of GLRaV-3 closterovirus for further studies.
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문제 정의
이 바이러스는 현재까지 초본 기주작물이 보고되어 있지 않아 바이러스 증식 및 관련 특성 실험에 많은 어려움이 있었으며, 포도나무에서도 발아기 신엽조직에서보다 생육 후반기의 완전히 전개된 성엽조직에서 병징이 뚜렷히 나타나는 등 시기적 제한성을 가지고 있어 다루기 힘든 바이러스였다. 본 실험은 이러한 시기적 제한성, 목본성 기주작물이라는 단점 등을 극복하기 위하여 조직배양기술을 이용하여 기내에 바이러스 이병주를 배양, 증식함으로써 바이러스의 증식.순화효율 및 검출효율의 향상을 위해 수행되었다.
본 실험은 이러한 시기적 제한성, 목본성 기주작물이라는 단점 등을 극복하기 위하여 조직배양기술을 이용하여 기내에 바이러스 이병주를 배양, 증식함으로써 바이러스의 증식.순화효율 및 검출효율의 향상을 위해 수행되었다.
가설 설정
Bars l-6=GLRaV-3 infected sample sap in a tenfold dilution series (1 : 10-1, 10"2, 10'\ 10-4, 10-5, 10-6, respectively). H=Healthy in vitro plantlet. Horizontal line marks positive cutoff at 0.
제안 방법
2가지 방법의 검정 효율을 비교하기 위하여 GLRaV-3이감염된 기내 배양묘의 잎 조직을 사용하여 각각 ELISA와 RT-PCR을 실시하였다. 기내 배양묘의 잎조직 100 mg에서 전체 RNA를 추출하여 50 μL에 녹인 다음 5 μL의 RNA를 template로 하여 10배수로 희석하여 RT-PCR을 수행하였고 ELISA의 경우에도 100 mg의 잎조직을 10배 양의 Tris-HCI 완충액으로 즙액을 추출하여 10배수로 희석하여 검정한계를 비교하였다.
ELISA로 검출된 GLRaV-3 이병주로부터 신초를 채취하여 1% NaOCl용액으로 5분간 살균한 다음 멸균수로 3회 수세한 후 약 1cm 길이로 신초의 줄기를 잘라서 조제하였다. 배 양배지는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지를 사용하여 BA 1.
Promega사의 Access RT-PCR system kit를 사용하여 5 μL의 template RNA를 0.5 mL tube에 넣고 AMV Reverse Transcriptase [0.1 M potassium phosphate (pH7.2), 0.2% Triton X-100, 2 mM DTT and 50% glycerol] 5 unit/μL, Tfl DNA Polymerase |50% glycerol, 20 mM Tris-HCI (pH8.0), 1 mM dithiothreitol (DTT), 100 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P40 and 0.5% Tween 20] 5 unit/eL, AMV /Tfl 5X reaction buffer 10 μL, 10 mM dNTP mix 1 euL, 25 mM MgSO4 2 μL, 33 pmole 농도의 upstream primer (Pl), downstream primer (P2) 각각 1 씩 넣은 RT-PCR mix를 tube에 첨가한 다음 RNase-free water를 tube 당 28 μL를 넣어 반응액이 총 50μL가 되도록 하였다. RT-PCR 반응은 BIOMETRA사의 UNOU 모델을 사용하여 먼저 48C에서 45분간 역전사 반응을 시킨 다음 94C에서 2분간 predenature 후 40 cycle로 94℃ 에서 30초간 denaturation, 60℃ 에서 1분간 annealing, 68℃에서 2분간 이ongaticm시키고 68C에서 7분간 최종 반응시킨 후 4C에서 보존하였다 PCR 산물은 1.
RNA 추출은 Qiagen RNeasy Plant mini kit를 사용하여 포장 재배주의 잎, 엽병+중륵조직 및 기내 배양묘의 줄기＋잎조직으로부터 Total RNA를 추출하였으며, Genbank (NCBI)를 검색하여 기 보고되어 있는 GLRaV-3의 염기서열을 기준으로 외피단백질유전자 부위를 증폭할 수 있도록 각각 25개의 염기로 primei.를 작성하였다 (Table 1).
5% Tween 20] 5 unit/eL, AMV /Tfl 5X reaction buffer 10 μL, 10 mM dNTP mix 1 euL, 25 mM MgSO4 2 μL, 33 pmole 농도의 upstream primer (Pl), downstream primer (P2) 각각 1 씩 넣은 RT-PCR mix를 tube에 첨가한 다음 RNase-free water를 tube 당 28 μL를 넣어 반응액이 총 50μL가 되도록 하였다. RT-PCR 반응은 BIOMETRA사의 UNOU 모델을 사용하여 먼저 48C에서 45분간 역전사 반응을 시킨 다음 94C에서 2분간 predenature 후 40 cycle로 94℃ 에서 30초간 denaturation, 60℃ 에서 1분간 annealing, 68℃에서 2분간 이ongaticm시키고 68C에서 7분간 최종 반응시킨 후 4C에서 보존하였다 PCR 산물은 1.2% agarose gel과 0.5X TAE buffer (40 mM Tris acetate2 mM EDTA)를 사용하여 100V에서 전기영동한 후 Ethidium bromide로 염색하여 UV illuminator에서 밴드를 관찰하였다.
실시하였다. 기내 배양묘의 잎조직 100 mg에서 전체 RNA를 추출하여 50 μL에 녹인 다음 5 μL의 RNA를 template로 하여 10배수로 희석하여 RT-PCR을 수행하였고 ELISA의 경우에도 100 mg의 잎조직을 10배 양의 Tris-HCI 완충액으로 즙액을 추출하여 10배수로 희석하여 검정한계를 비교하였다.
후 약 1cm 길이로 신초의 줄기를 잘라서 조제하였다. 배 양배지는 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지를 사용하여 BA 1.0 mgㆍL-1, NAA 0.01 mgㆍL-1로 첨가한 배지에 조제한 줄기를 치상하여 direct 아looting을 유기함으로써 기내 조직배양묘(in vitro plantlet)를 양성하였다.
배양묘는 30일 간격으로 계대배양하여 증식시키면서 배양 횟수에 따른 기내 조직배양묘의 바이러스 농도변화와 배양묘의 잎, 줄기와 줄기유래의 callus 조직 등 조직 부위별로 바이러스 검출 여부도 ELISA로 조사하였다. 스위스 BIOREBA 사로부터 IgG와 alkaline phosphatase가 결합된 conjugated-IgG를 구입하여 ELISA 진단에 사용하였다 시료는 Tris-HCI buffer를 10배량 (w/v) 첨가, 마쇄하여 즙액을 추출하였다.
병징을 나타내는 잎 80 g과 기내 배양묘의 잎, 줄기, 캘러스를 포함한 전 식물체 조직 40 g을 액체질소로 마쇄하여 저속 및 고속 원심 분리를 반복하여 바이러스를 부분 순화한 후 CSzSO-sucrose density gradient (Bar- Joseph 등 1985; Hu 등 1990)에서 형성된 우윳빛 band를 취한 후 농축하여 정제된 바이러스를 얻었다. 정제 바이러스는 Carl zeiss 906E 투과전자현미경 (TEM)을 사용하여 입자를 관찰하였으며, 기내 배양묘의 잎과 포장의 병징발현된 잎을 대상으로 dip법에 의해 입자를 관찰하였다.
대상 데이터
바이러스 정제는 기내 배양묘의 잎, 줄기 등 전 조직과 포장 재배주의 이병엽, 엽병과 엽맥 등 사부조직을 바이러스 정제에 사용하였으며 포장 재배주의 시료는 잎이 적색으로 변하는 병징 발현초기에 채취하였다. 바이러스 정제방법은 Hu 등 (1990)과 Bar-Joseph 등의 방법 (1985)을 다소 변형시킨 방법을 사용하였다.
병징 발현초기에 채취하였다. 바이러스 정제방법은 Hu 등 (1990)과 Bar-Joseph 등의 방법 (1985)을 다소 변형시킨 방법을 사용하였다. 병징을 나타내는 잎 80 g과 기내 배양묘의 잎, 줄기, 캘러스를 포함한 전 식물체 조직 40 g을 액체질소로 마쇄하여 저속 및 고속 원심 분리를 반복하여 바이러스를 부분 순화한 후 CSzSO-sucrose density gradient (Bar- Joseph 등 1985; Hu 등 1990)에서 형성된 우윳빛 band를 취한 후 농축하여 정제된 바이러스를 얻었다.
성능/효과
RT-PCR 진단에서 포장 재배주의 어린 잎조직에서는 바이러스 농도가 너무 낮아 검출되지 않았지만 포장재배주의 엽병과 중륵조직 및 기내 배양묘에서는 약 942 bp 정도의 GLRaV-3 외피단백질유전자 크기의 특이 밴드가 나타났고 특히 기내 배양묘 조직에서 검출이 가장 용이하였다 (Figure 1). 기내 배양묘에서 추출한 RNA를 각 1 ~9μL씩을 주형으로 사용하여 RT-PCR 하였을 때 1 μL의 적은 양으로도 뚜렷한 밴드가 검출되어 기내 배양묘의 viral RNA 농도가 충분히 높고 PCR 반응을 저해하는 요소들이 적어 양질의 RNA가 분리되 었음을 알 수 있었다 (Figure 2).
없었다. 그렇지만 RT-PCR의 경우 아주 미약하지만 10-6까지 검출이 가능하여 ELISA법에 비해 1,000배 정도 검출감도가 높은 것으로 나타났다 (Figure 3). Minafra 등 (1992)이 포도에서 Grapevine virus A RNA의 검출한계가 RT-PCR법이 ELISA나 분자교잡법에 비해 200배 정도로 높았다고 보고한 데 반해 본 실험의 결과가 5배 정도로 큰 차이를 나타낸 것은 바이러스 검출이 용이한 기내 배양묘를 이용하였기 때문인 것으로 생각된다.
그리고 잎, 줄기 및 줄기 유래의 callus 조직에서 모두 고농도의 바이러스가 검출되어 기내식물체의 분화와 더불어 바이러스도 증식함을 확인할 수 있었다 (Table 3). 위의 결과는 Price 등 (1996)이 원형질체에서의 faHer/eqfvirus (CTLV)의 복제를 최초로 보고한 결과와 마찬가지로 미분화조직인 줄기 유래의 callus 조직에서도 바이러스가 복제되고 있음을 알 수 있었다.
기내 배양묘에서 추출한 RNA를 각 1 ~9μL씩을 주형으로 사용하여 RT-PCR 하였을 때 1 μL의 적은 양으로도 뚜렷한 밴드가 검출되어 기내 배양묘의 viral RNA 농도가 충분히 높고 PCR 반응을 저해하는 요소들이 적어 양질의 RNA가 분리되 었음을 알 수 있었다 (Figure 2).
또한 기내 배양묘를 이용해 RT-PCR과 ELISA법의 바이러스 검출감도를 비교한 결과, ELISA의 경우 으로 희석하였을 때까지 검출이 가능하였으며 10-1부터는 건전대조구에 비해서는 다소 높은 흡광도를 보였으나 양성반응으로 볼 수는 없었다. 그렇지만 RT-PCR의 경우 아주 미약하지만 10-6까지 검출이 가능하여 ELISA법에 비해 1,000배 정도 검출감도가 높은 것으로 나타났다 (Figure 3).
바이러스 감염주의 신초를 기내 배양하여 양성된 기내 배양묘를 30일 간격으로 계대배양하여 증식시키면서 배양 횟수에 따른 바이러스 농도변화를 ELISA로 조사한 결과, 바이러스 농도는 계속 고농도로 유지되고 있었다 (Table 2). 그리고 잎, 줄기 및 줄기 유래의 callus 조직에서 모두 고농도의 바이러스가 검출되어 기내식물체의 분화와 더불어 바이러스도 증식함을 확인할 수 있었다 (Table 3).
포도나무에서 GLRaV-3을 검정하고자 할 때 바이러스 농도가 낮고 시료준비가 어려운 식물체 조직을 이용하는 것에 비해 기내에서 바이러스 증식이 비교적 빠르고 억제물질들이 적은 기내 배양묘를 이용함으로써 100 mg 정도의 적은 양으로 검출이 가능한 RT-PCR 진단 효율성을 높일 수 있었다. 또한 초본성 증식 기주작물이 아직까지 없어 증식상의 어려움과 목본성 식물체 조직 내에 많은 페놀화합물과 저농도의 바이러스 양 때문에 바이러스 정제가 어려운 문제 등을 조직배양 기술을 이용함으로써 효과적으로 극복할 수 있을 것으로 생각한다.
후속연구
또한 초본성 증식 기주작물이 아직까지 없어 증식상의 어려움과 목본성 식물체 조직 내에 많은 페놀화합물과 저농도의 바이러스 양 때문에 바이러스 정제가 어려운 문제 등을 조직배양 기술을 이용함으로써 효과적으로 극복할 수 있을 것으로 생각한다. 따라서 감염성 초본 기주식물이 보고될 때까지는 기내 배양묘를 이용하는 방법이 GLRaV-3 Closterovims의 연구 진전에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 포도나무의 생육시기와 조직에 따라 바이러스 농도가 불균일한 점을 고려할 때 기내 배양묘를 이용함으로써 바이러스 검출 오류를 줄일 수 있고, 시기적 제한성을 극복하고 연중 실험이 가능하다는 점에서도 기내 배양묘의 이용 효율성이 클 것으로 판단되며, phloem에만 제한적으로 존재하고 농도가 낮은 바이러스와 같은 다루기 어려운 다른 과수작물의 바이러스들에서도 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
있었다. 또한 초본성 증식 기주작물이 아직까지 없어 증식상의 어려움과 목본성 식물체 조직 내에 많은 페놀화합물과 저농도의 바이러스 양 때문에 바이러스 정제가 어려운 문제 등을 조직배양 기술을 이용함으로써 효과적으로 극복할 수 있을 것으로 생각한다. 따라서 감염성 초본 기주식물이 보고될 때까지는 기내 배양묘를 이용하는 방법이 GLRaV-3 Closterovims의 연구 진전에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
따라서 감염성 초본 기주식물이 보고될 때까지는 기내 배양묘를 이용하는 방법이 GLRaV-3 Closterovims의 연구 진전에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 포도나무의 생육시기와 조직에 따라 바이러스 농도가 불균일한 점을 고려할 때 기내 배양묘를 이용함으로써 바이러스 검출 오류를 줄일 수 있고, 시기적 제한성을 극복하고 연중 실험이 가능하다는 점에서도 기내 배양묘의 이용 효율성이 클 것으로 판단되며, phloem에만 제한적으로 존재하고 농도가 낮은 바이러스와 같은 다루기 어려운 다른 과수작물의 바이러스들에서도 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
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