선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 1999; Moon and Youn 1999), 기존 번식법의 대안이 될 수 있음이 시사되고 있으나 유전자형에 따른 체세포 배 유도는 연구가 미진한 상태이다. 본 시험은 우량한 두릅나 무의 효율적인 기내 번식기술 개발을 목적으로 국내에서 선 발하거나 일본과 중국에서 도입한 두릅나무를 대상으로 체세 포배 유도에 미치는 유전자형의 효과를 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 2000). I-SSR PCR 분석을 위하여 20 ng의 주형 DNA, 0.6 “M의 primer, 0.5 #의 BSA (Bovine Serum Albumin, Takara, Japan), 1.5 mM MgCh, 100 /zM의 dNTPs (MBI, Lithuania), 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, pH, 8.3, 0.6 unit의 Taq DNA polymerase (AB gene, UK)를 섞어서 PTC-200PCR 기기 (MJ Research, USA)< 사용해 서 반응시켰다. PCR의 온도순환 조건은 94℃에서 5분간 전 처리를 하고, 94℃에서 30초간 열변성, 52℃에서 30초간 primer 결합, 72℃에서 1분간 DNA 합성의 세 과정을 45회 반복 수행하고, 72℃에서 10분간 DNA 합성을 완료시켰다.
- PCR의 온도순환 조건은 94℃에서 5분간 전 처리를 하고, 94℃에서 30초간 열변성, 52℃에서 30초간 primer 결합, 72℃에서 1분간 DNA 합성의 세 과정을 45회 반복 수행하고, 72℃에서 10분간 DNA 합성을 완료시켰다. PCR 증폭산물은 IX TBE 용액을 이용해서 제조한 2% agarose gel을 이용하여 분획하였으며, 증폭산물의 크기를 계산하기 위하여 100 bp ladder DNA size marker (ABgene, UK)를 별도의 lane에서 동시에 전기영동을 수행한 후 EtBr 로 염색하여 자외선 분광기 상에서 사진 촬영하여 관찰하였다. 증폭산물 변이체는 gel상의 동일한 위치에 증폭산물이 있고 없음을 기준으로 증폭산물이 있을 경우 1, 없을 경우 0으 로 기록하여 실험을 통해서 분석된 전 개체에 대하여 조사표 를 작성하였다.
- 두릅나무 15개체의 동아 (冬芽)를 절편으로 체세포배 유도 에 미치는 유전자형의 효과를 검토하였다. 캘러스는 MS 기본 배지에 1.
- 0mg/L2, 4-D를 처리하여 4주간 배양하여 유도하였 고, 1/2 MS 기본배지로 옮겨 5주간 배양하여 체세포배를 유 도하였다. 또한 동일한 개체의 잎을 재료로 CTAB 방법으로 genomic DNA를 추출하여 I-SSR 표지자 분석을 수행하였다. 관찰된 LSSR 표지자 변이체에 근거하여 UPGMA법에 의해 유집분석을 실시한 결과, 체세포배 유도에 미치는 유전 자형의 효과가 관찰되었다.
- 해부용 칼로 2~4 mm 크기의 절편을 만들어 샤레당 10~20개씩 치상하여 3반복에서 10반복으로 배양하였다. 배지는 캘러스 유도배 지와 체세포배 유도배지로 나누어 사용하였다. 캘러스의 유도는 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지에 1.
- 05% 활 성탄이 첨가된 1/2 MS 배지에 계대배양하여 발아 및 식물체 재분화를 도모하였다. 재분화된 식물체는 동일한 배지가 담긴플라스틱 배양용기 (15x5 cm, Yongln, TongYang Mool San Co. Ltd., Korea)에 옮겨 4주간 성장시킨 다음 인공배양 토 (피트모스 (1) : 펄라이트 (1) v/v)로 옮겨 간헐적인 관수 로 습도를 높게 유지하여 활착시킨 후 폿트묘로 육성하였다. 순화된 묘목은 포지에 이식하여 생장을 관찰하였다.
- PCR 증폭산물은 IX TBE 용액을 이용해서 제조한 2% agarose gel을 이용하여 분획하였으며, 증폭산물의 크기를 계산하기 위하여 100 bp ladder DNA size marker (ABgene, UK)를 별도의 lane에서 동시에 전기영동을 수행한 후 EtBr 로 염색하여 자외선 분광기 상에서 사진 촬영하여 관찰하였다. 증폭산물 변이체는 gel상의 동일한 위치에 증폭산물이 있고 없음을 기준으로 증폭산물이 있을 경우 1, 없을 경우 0으 로 기록하여 실험을 통해서 분석된 전 개체에 대하여 조사표 를 작성하였다.
- 모든 배양은 24±2℃, 1일 16시간 조명 (40 乂molm's』의 냉백색 형광등)이 되는 배양실에서 실시하였다. 캘러스 유도는 4주간, 체세포배 유도는 계대배 양 후 5주간 실시하였다.
- 캘러스 유도배지에서 4주간 배양한 다음 1/2 MS 기본배지 에 계대하여 체세포배를 유도하였다. 체세포배는 계대배양 후 2주부터 형성되었는데 어뢰형 단계까지 자랐을 때 0.
- 두릅나무 15개체의 동아 (冬芽)를 절편으로 체세포배 유도 에 미치는 유전자형의 효과를 검토하였다. 캘러스는 MS 기본 배지에 1.0mg/L2, 4-D를 처리하여 4주간 배양하여 유도하였 고, 1/2 MS 기본배지로 옮겨 5주간 배양하여 체세포배를 유 도하였다. 또한 동일한 개체의 잎을 재료로 CTAB 방법으로 genomic DNA를 추출하여 I-SSR 표지자 분석을 수행하였다.
- 배지는 캘러스 유도배 지와 체세포배 유도배지로 나누어 사용하였다. 캘러스의 유도는 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지에 1.0 mg/L 2, 4- dichlorophenoxy acetic acid (2, 4-D), 2% sucrose를 첨가하고, 0.3% gelrite로 경화하여 사용하였고, 체세포배의 유도는 1/2 MS 기본배지를 사용하였다. 배지는 멸균소독 후 1회용petri dish (87x15 mm, Yongln, GCM Inc.
- 표면살균 후 동아의 인편을 핀셋으로 조심스럽게 벗겨낸 다음 어린 싹을 절편으로 캘러스를 유도하였다. 해부용 칼로 2~4 mm 크기의 절편을 만들어 샤레당 10~20개씩 치상하여 3반복에서 10반복으로 배양하였다.
- 표면살균 후 동아의 인편을 핀셋으로 조심스럽게 벗겨낸 다음 어린 싹을 절편으로 캘러스를 유도하였다. 해부용 칼로 2~4 mm 크기의 절편을 만들어 샤레당 10~20개씩 치상하여 3반복에서 10반복으로 배양하였다. 배지는 캘러스 유도배 지와 체세포배 유도배지로 나누어 사용하였다.
대상 데이터
- 개체목은 선발장소 의 이름을 붙여 오대 1, 2 등으로 명명하였다 (Table 1). 일본 에서 도입한 '신구는 충북 제천시 청풍면 소재 농장에서, 중국은 중국 길림성에서 도입한 것으로 경기도 안성시 소 재 농원에서 채취하였다. 채취 당시 두릅순의 상태는 지역에따라 다소 차이는 있으나 동아가 막 터져 나오거나 나오기 직전의 것으로서 당년생 정아지를 약 20 cm로 절취하여 젖은 종이로 싸서 비닐팩에 넣어 운반하고, 4℃ 의 냉장고에 저장 하여 1주 이내에 배양하였다.
- 전국 10개소에서 1999년 4월 중순에서 5월 초에 걸쳐 두 릅나무 15개체를 임의 선발하였다. 개체목은 모두 맹아로 갱 신된 것으로 1~2.
데이터처리
- 개체별로 정리된 자료를 이용해서 I-SSR 증폭산물 변이체 의 공유 정도에 의해 계산되는 개체간 유전적 거리를 컴퓨터프로그램 RAPDDIST vl.O (Black 1996)을 이용하면서 Manhattan Distances (Prevosti distance, Wright 1978) 공식에 의거해서 계산했으며, 개체간 유전적 유연관계를 UPGMA(phylip v3.
이론/모형
- 개체별로 정리된 자료를 이용해서 I-SSR 증폭산물 변이체 의 공유 정도에 의해 계산되는 개체간 유전적 거리를 컴퓨터프로그램 RAPDDIST vl.O (Black 1996)을 이용하면서 Manhattan Distances (Prevosti distance, Wright 1978) 공식에 의거해서 계산했으며, 개체간 유전적 유연관계를 UPGMA(phylip v3.5c; Felsenstein, 1993)법으로 분석하였다.
- 잎을 재료로 CTAB 방법을 이용하여 genomic DNA를 추 출하였다 (Hong et al. 2000). I-SSR PCR 분석을 위하여 20 ng의 주형 DNA, 0.
성능/효과
- 5~100%까지, 체세포배 유도는 0~100%까지 차이를 나 타냈다. I-SSR 표지자 유집분석 결과 유전적으로 유사한 개 체에 있어서도 체세포배 유도에 차이를 보여 개체목 간의 전 반적인 유전적 유사성보다는 특정 유전자에 의한 영향을 많이 받는 것으로 추정되었다. 체세포배 유도율이 저조하거나 유도가 되지 않았던 울릉도-7, 제주도-1, 신구 및 중국 등 4개 체는 다른 개체들에 비해서 비교적 유전적 유사성이 높은 것으로 나타나 이들 개체의 체세포배 유도를 통한 식물체 생산 은 비효율적인 것으로 보이며, 기타 개체들에 대해서는 유전 적 유사성 이외의 생리적 요인에 관여하는 유전자의 탐색 및 활용이 필요할 것으로 생각된다.
- LSSR 표지자 분석을 기초로 UPGMA법에 의한 유집분석 결과, 체세포배 유도는 유전자형에 따라 어느 정도 영향을 받는 것으로 나타났다 (Table 1, Figure 3). 동일한 분지군에 속 하여 다른 개체들에 비해 유전적으로 가까운 것으로 나타난 울릉도-7, 제주도-1, 신구 및 중국 개체들은 공히 체세포배의 유도가 매우 어려운 개체들로서 이들은 상대적으로 나머지 개체들과는 비교적 유전적 차이가 큰 개체들로 생각되었다.
- 또한 동일한 개체의 잎을 재료로 CTAB 방법으로 genomic DNA를 추출하여 I-SSR 표지자 분석을 수행하였다. 관찰된 LSSR 표지자 변이체에 근거하여 UPGMA법에 의해 유집분석을 실시한 결과, 체세포배 유도에 미치는 유전 자형의 효과가 관찰되었다. 캘러스 유도는 유전자형에 따라 58.
- 나머지 2개의 분지군에 산재하여 있는 것으로 나타난 국내 선발개체들은 각 분지군 내에서 비교적 유전적 거리가 유사 하게 나타난 개체에 있어서도 체세포배 유도율의 차이가 크게 나타났다. 따라서 본 연구에서 분석된 유전적 차이가 두릅 나무의 체세포배 유도능력을 결정짓는 직접적인 유전적 요인 은 아닐지라도 최소한 울릉도-7 등이 속한 분지군의 개체들은 나머지 국내 선발개체들과는 유전적으로 차이가 있음을 알 수 있었다.
- 그러나 Trigiano 등 (1999)은 시료의 발달단계 및 생리적 상태가 체세포배 유 도를 위한 결정적인 요인임을 밝히면서 체세포배 유도의 최적 ltime window, 는 지리적 조건, 생장입지 및 기후조건에 #-라 다르다고 하였다. 따라서 유전자형에 따른 체세포배 발생 능력의 차이는 배양조건의 최적화를 통해 어느 정도 극복 될 수 있는 요인임을 나타내었다.
- 본 실험에서 I-SSR 표지자 분석에 근거해 볼 때 동일 수종 내에서도 배양조건에 잘 반응하는 유전자형의 선발이 필요함 은 물론 배양시기나 시료의 선택 등도 고려해야 될 내용임을 시사해 준다. 이러한 유전자형의 차이는 기내반응이 양호하여 목본식물 조직배양의 모델이 되어 있는 포플러류에서도 심한 것으로 보고된 바 있다.
- 본 실험에서 나타난 체세포배 발생 빈도의 차이는 ISSR 분석 결과 유전자형의 차이로 나타났으나 모수의 연령이나 생 리적 차이에 따른 요인이 체세포배의 발생에 영향을 주었을 가능성도 완전히 배제하기 어렵다. 본 실험에 사용한 재료는 모두 맹아로 갱신된 당년생 줄기임에도 불구하고 그 나무가 지닌 모수령은 다를 수 있으며, 선발지역의 입지적, 기후적인 차이와 겨울철 해빙 이후 수액이동 등 나무의 생리적 상태가 매우 다를 수 있기 때문이다.
- 환경순화 된 식물체는 비닐 폿트로 이식하였을 때 2개월 후에는 20 cm 내외로 자랐고 (Figure 2C), 포장이식 후 정상 적으로 생장하였다 (Figure 2D). 이상의 과정에서 유전자형에 따른 차이는 거의 나타나지 않았으며 두릅나무의 경우 일단 체세포배가 유도되면 그 이후의 식물체의 재분화 및 순화는 큰 문제가 없을 것으로 생각되었다.
- 캘러스는 절단면에서 주로 유도되었다. 절편에 따라 백색, 옅은 녹색 혹은 노란색 계통으로 유도되었으며, 캘러스의 형 성 없이 절편이 부풀어오르거나 갈변화되는 것도 나타났다. 캘러스 형성률은 대체로 90% 이상이었으나 양구 10호와 석 현 2호는 58.
- 5 cm까지 생장되었 다 (Figure 1A). 체세포배 유도율은 유전자형 및 절편에 따른차이가 심하여 전혀 체세포배가 형성되지 않는 것에서 100% 까지 차이를 보였다 (Table 1). 체세포배 유도는 이식 2주 후 부터 관찰되었고, 캘러스 표면에서 유도되기도 하였으나 주로 배지와의 접촉 부위에서 유도되었다 (Figure IB).
후속연구
- (Ahuja 1983). 또한 배지 및 생장조절 제의 선택, 시료의 선택 등 최적 배양조건의 확립이 효율적인 기내번식의 관건이 되는 만큼 (Brown et al. 1995) 체세포배 유도 빈도가 낮거나 유도가 되지 않은 개체에 대해서는 배양 조건의 최적화에 대한 실험이 요구된다. 아울러 유전적 요소 가 배양에 미치는 영향을 정확히 평가하기 위해서는 배양이 잘되는 개체와 그렇지 못한 개체의 교배를 통해서 차대 가계 를 확보하여 체세포 배발생에 관여하는 유전자의 탐색연구가 필요하다.
- 1995) 체세포배 유도 빈도가 낮거나 유도가 되지 않은 개체에 대해서는 배양 조건의 최적화에 대한 실험이 요구된다. 아울러 유전적 요소 가 배양에 미치는 영향을 정확히 평가하기 위해서는 배양이 잘되는 개체와 그렇지 못한 개체의 교배를 통해서 차대 가계 를 확보하여 체세포 배발생에 관여하는 유전자의 탐색연구가 필요하다.
- I-SSR 표지자 유집분석 결과 유전적으로 유사한 개 체에 있어서도 체세포배 유도에 차이를 보여 개체목 간의 전 반적인 유전적 유사성보다는 특정 유전자에 의한 영향을 많이 받는 것으로 추정되었다. 체세포배 유도율이 저조하거나 유도가 되지 않았던 울릉도-7, 제주도-1, 신구 및 중국 등 4개 체는 다른 개체들에 비해서 비교적 유전적 유사성이 높은 것으로 나타나 이들 개체의 체세포배 유도를 통한 식물체 생산 은 비효율적인 것으로 보이며, 기타 개체들에 대해서는 유전 적 유사성 이외의 생리적 요인에 관여하는 유전자의 탐색 및 활용이 필요할 것으로 생각된다. 따라서 두릅나무의 효율적인 기내번식을 위해서는 일차적으로 배양이 잘되는 개체의 선발 이 필요하지만 배지, 시료의 선택 등 배양조건의 최적화 역시 필요함을 시사해 준다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.