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문제 정의
- 일반적으로 식물의 형질전환은 유전자 전이와 재분화라는 2단계로 크게 구분할 수 있고, 이에는 여러가지 요인이 복합적으로 관여한다고 알려져 있으나 사과의 경우에는 연구가 미미한 실정에 있다. 따라서 일반 작물의 형질 전환에서 중요하게 영향하는 것으로 알려진 몇 가지 요인에 대한 사과 갈라 품종의 형질전환을 연구하여 효율적인 형질 전환 기술을 확립코자 본 연구를 수행하였다.
- 사과 갈라 품종의 고효율 형질전환 기술체계를 확립하기 위하여 Agobacteriwn을 이용한 형질전환에 관여하는 상처유 도 방법, 배지 고형물, 엽절편체 기원, acetosyringone의 농도 와 MES첨가 등 몇 가지 요인이 재분화 및 형질전환에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. 엽절편체의 상처유도는 수술용핀셋 (nori-traumatic fore아))의 사용보다는 단순한 절단 후 균접종과 3일 공동배양을 할 경우 재분화와 형질전환율이 더 증가하는 경향을 나타냈다.
제안 방법
- 상처유도는 단순절단 또는 수술용 핀셋으로 눌러 처리하였고 엽 절편체 기원은 증식배지와 엽신장배지에서 배양 4주 후의 신 초 유래를 상호 비교하였다. Acetosyringone의 농도는 0~0.20mM의 범위에서 0.05 mM 농도의 간격으로 처리하였 으며 재분화 배지의 고형물 조성은 agar (A)와 Gelrite® (G) 의 조합으로 7.0 A, 3.5 A+1.2 G 및 3.5 G 등 3수준 처리하였다. 형질전환율은 PCR 분석을 거쳐 목적 유전자의 삽입이 확 인된 신초유도 절편체의 비율로 계산하였으며, 이들 잠정적인 형질전환체들은 southern blot 분석 으로 재확인되었다.
- DNA는 Shure 등 (1983)의 방법에 따라 추출하였고, PCR 반응은 최초 95 ℃ 에서 5분간 denaturation 한 후, 95 ℃ 에서 30 초간 denaturation, 65℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 elongation 의 30회 반복한 후, 최종 72℃ 에서 7분간 elongation 과정으로 수행하였다. PCR 증폭에 사용한 primer는 nptll 유전자의 증폭을 위해서 5' -GAGGCTATTCGGC TATGACT-3' 와 5 JAATCTGTGATGGCAGGTTG-3'을, MdMADS2 유전자의 증폭을 위해서는 5, -CAGAAGCCAT CTGTGTGTCA-3' 와 5' -AGAGATAGATCGAGTCTAGG-3, 을 사용하였다. 증폭된 DNA밴드의 크기는 각각 0.
- 7% agarose gel에서 전기영동한 후 nylon membrane에 전이하였다. Probe의 작 성과 Hybridizatione MdMADS2 유전자가 증폭된 DNA절 편체를 digoxigenin-11 -dUTP labeling kit (Roche Cat. No.15856140)를 이용하여 수행하였다.
- 이는 갈라 품종의 경우 다른 품종에서와는 달리 증식배지에서도 발육이 왕성한 새로운 유엽을 선별할 수 있는 식물적 특성을 가지고 있기 때문인 것으로 보아진다. 그러므로 이후의 실험은 증식배지 기원의 유엽을 단순절단하여 상처를 유도한 후 agar 배지에서 재분화를 유도하는 과정으로 수행되었다.
- 유전자 전이 및 재분화 단계에서 여러가지 요인이 형질전 환에 미치는 영향을 살펴보고자, 상처유도 방법, 엽절편체 기 원, acetosyringone의 농도, 재분화 배지의 고형물 조성과 pH 안정제인 MES [2-(N-Morpholino) ethansulfonic acid]의 첨가에 따른 신초 재분화율 및 형질전환율을 조사하였다. 상처유도는 단순절단 또는 수술용 핀셋으로 눌러 처리하였고 엽 절편체 기원은 증식배지와 엽신장배지에서 배양 4주 후의 신 초 유래를 상호 비교하였다. Acetosyringone의 농도는 0~0.
- 엽신장 배지의 신초 유엽을 절취하여 상단부와 엽병 조직 을 제거하고, 하단부의 엽절편체를 수술용 핀셋 (non-trauma- tic forcep)으로 눌러 상처를 유도 (Norelli et al. 1996)한 후, binary vector pGA 1532 (Figure 1)를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404를 접종하였다. Agrobacterium 의 배양은 Song et al.
- 유전자 전이 및 재분화 단계에서 여러가지 요인이 형질전 환에 미치는 영향을 살펴보고자, 상처유도 방법, 엽절편체 기 원, acetosyringone의 농도, 재분화 배지의 고형물 조성과 pH 안정제인 MES [2-(N-Morpholino) ethansulfonic acid]의 첨가에 따른 신초 재분화율 및 형질전환율을 조사하였다. 상처유도는 단순절단 또는 수술용 핀셋으로 눌러 처리하였고 엽 절편체 기원은 증식배지와 엽신장배지에서 배양 4주 후의 신 초 유래를 상호 비교하였다.
- 9 내외이다. 접종한 절편체는 3일간의 공동배양 후, 재분화 배지에서 4주 암배양, 2주 약광 배양과 2주 강광 배양단계를 차례로 진행하였고, 재분화 신초를 항생제 첨가발근 배지에서 재선발한 후 순화하였다 (Song et al. 2000;Song and Seong 2000).
- PCR 증폭에 사용한 primer는 nptll 유전자의 증폭을 위해서 5' -GAGGCTATTCGGC TATGACT-3' 와 5 JAATCTGTGATGGCAGGTTG-3'을, MdMADS2 유전자의 증폭을 위해서는 5, -CAGAAGCCAT CTGTGTGTCA-3' 와 5' -AGAGATAGATCGAGTCTAGG-3, 을 사용하였다. 증폭된 DNA밴드의 크기는 각각 0.8 kb 와 1.1 kb로서, 1.0% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다. Southern blot 분석은 추출한 genomic DNA를 EcoRI 및 Hindlll 또는 HindHI로 절단처리하여 0.
- 5 G 등 3수준 처리하였다. 형질전환율은 PCR 분석을 거쳐 목적 유전자의 삽입이 확 인된 신초유도 절편체의 비율로 계산하였으며, 이들 잠정적인 형질전환체들은 southern blot 분석 으로 재확인되었다.
- 형질전환을 위한 엽절편체의 기원이 재분화 및 형질전환율 에 미치는 영향을 살펴보고자, 증식을 위한 계대배양 4주 후 의 유엽과 엽신장 배지로 옮긴 4주 후의 유엽의 효과를 비교 하였다. Table 3에서와 같이 엽절편체의 기원에 따른 재분화 율의 차이는 없었으나, 증식배지에서의 유엽을 사용할 경우 형질전환율이 증가하는 경향을 나타냈다.
이론/모형
- 1996)한 후, binary vector pGA 1532 (Figure 1)를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404를 접종하였다. Agrobacterium 의 배양은 Song et al. (2000)의 방법에 따라 수행하였으며, 이때 초기 배 양농도와 병원성유도 농도는 각각 ODooo 1.0 내 외와 OD600 0.9 내외이다. 접종한 절편체는 3일간의 공동배양 후, 재분화 배지에서 4주 암배양, 2주 약광 배양과 2주 강광 배양단계를 차례로 진행하였고, 재분화 신초를 항생제 첨가발근 배지에서 재선발한 후 순화하였다 (Song et al.
- DNA는 Shure 등 (1983)의 방법에 따라 추출하였고, PCR 반응은 최초 95 ℃ 에서 5분간 denaturation 한 후, 95 ℃ 에서 30 초간 denaturation, 65℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 elongation 의 30회 반복한 후, 최종 72℃ 에서 7분간 elongation 과정으로 수행하였다. PCR 증폭에 사용한 primer는 nptll 유전자의 증폭을 위해서 5' -GAGGCTATTCGGC TATGACT-3' 와 5 JAATCTGTGATGGCAGGTTG-3'을, MdMADS2 유전자의 증폭을 위해서는 5, -CAGAAGCCAT CTGTGTGTCA-3' 와 5' -AGAGATAGATCGAGTCTAGG-3, 을 사용하였다.
성능/효과
- 2000). Acetosyringone 의 농도별 재분화 및 형질전환의 반응을 분석한 결과, 0.1 mM 이상의 첨가가 재분화율과 형 질전환율을 유의하게 증가시켰는데, 0.15 mM의 농도에서 형질전환율이 가장 높은 경향을 보였다 (Table 4). 이는 사과의 경우 0.
- Gekiie®를 이용한 항생제 첨가 고형배지에서 재분화 유도 가정 중에, # Wijcik 품종과 비교하여 과수화(hyperhydration) 발생이 많았는데 (data not shown), 이를 억제하여거전 재분화 신초발생 및 형질전환율을 제고하고자 배지의 고형물 조성을 달리하여 처리한 결과, Table 2에서와 같이 Gelrite® 비율이 높을수록 재분화율은 높게 나타났으나, 형질 건환율에 있어서는 처리 간에 차이가 없어, Gelrite®가 오히려 과수화 신초 및 escape 의 발생을 증가시키는 것으로 나타났다. 이는 N6배지의 경우 사과에서 일반적으로 발생하는 과 수화 현상을 줄일 수 있으며, agar또는 Gelrite® 단용처리보 나는 오히려 혼용처리에서 과수화를 줄이고 정상신초의 발생 ± 증가하나, 형질전환율은 오히려 agar의 비율이 높을수록 즈가하였다는 Bolar 등 (1999)의 연구결과와 유사하였다.
- 이는 N6배지의 경우 사과에서 일반적으로 발생하는 과 수화 현상을 줄일 수 있으며, agar또는 Gelrite® 단용처리보 나는 오히려 혼용처리에서 과수화를 줄이고 정상신초의 발생 ± 증가하나, 형질전환율은 오히려 agar의 비율이 높을수록 즈가하였다는 Bolar 등 (1999)의 연구결과와 유사하였다. 그 터U로 실험의 효율면에서 사과 갈라 품종의 형질전환에서는 버지 고형물로서 agar를 단독으로 사용하는 것이 바람직하다 고 보아졌다.
- 이는 Norelli 등 (1996)의 보고와는상반된 연구결과이나, 품종에 따른 차이로 보아진다. 또한 수 술용 핀셋을 이용한 상처의 재유도는 작업과정의 복잡함과 비용을 고려할 때, 오히려 비효율적인 것으로 판단되었다.
- 0 A의 처리 간에 차이가 없었다. 엽신장배 지 또는 증식배지 유래가 재분화 및 형질전환율에 유의한 차이를 보이지는 않았으나, 증식배지 유래가 형질전환율을 더높이는 경향을 나타냈다. Acetosyringonee 0.
- 엽절편체의 상처유도 방법이 형질전환에 미치는 영향을 알 아보고자 단순절단과 절단 후 수술용 핀셋의 누름에 의한 전 조직의 상처유도 처리한 결과, 통계적인 유의차는 없었으나 재분화율과 형질전환율이 단순절단 처리에서 보다 높은 경향을 나타냈다 (Table 1). 이는 Norelli 등 (1996)의 보고와는상반된 연구결과이나, 품종에 따른 차이로 보아진다.
- 사과 갈라 품종의 고효율 형질전환 기술체계를 확립하기 위하여 Agobacteriwn을 이용한 형질전환에 관여하는 상처유 도 방법, 배지 고형물, 엽절편체 기원, acetosyringone의 농도 와 MES첨가 등 몇 가지 요인이 재분화 및 형질전환에 미치는 영향에 대하여 연구하였다. 엽절편체의 상처유도는 수술용핀셋 (nori-traumatic fore아))의 사용보다는 단순한 절단 후 균접종과 3일 공동배양을 할 경우 재분화와 형질전환율이 더 증가하는 경향을 나타냈다. Agar (A)와 Gelrite® (G)의 조성 에 따른 배지 고형물의 처리에서는 Gelrite의 농도가 높을수 록 재분화율이 증가하였으나, 형질전환율에 있어서는 2.
- 1 kb) 유전자를 확인할 수 있었으며 (Figure 2), 이는 southern blot 분석을 통하여 재확인하였다 (Figure 2; Table 2). 항생제 첨 가 발근 배지에서 재선발된 총 72개 개체로부터 67개 개체에서 항생제 선발 유전자의 삽입이 확인되어 사과에서 93.1% 의 높은 비율로 간접선발이 가능하였고, 이 중 91.0%가 목적 유전자를 가지고 있는 것으로 나타났다 (data not shown).
- 항생제가 첨가된 발근배지에서의 재선발 과정을 거친 식물 체 내로의 목적유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여 순화 식물체의 genomic DNA를 추출하여 PCR 분석을 실시한 결과, 형질전환체에서는 nptll (0.8 kb)와 MdMADS2 (1.1 kb) 유전자를 확인할 수 있었으며 (Figure 2), 이는 southern blot 분석을 통하여 재확인하였다 (Figure 2; Table 2). 항생제 첨 가 발근 배지에서 재선발된 총 72개 개체로부터 67개 개체에서 항생제 선발 유전자의 삽입이 확인되어 사과에서 93.
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