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문제 정의
- 본 실험은 세 가지 고추속 식물 (C. anuumm, C. bacatu- um, C. chacoense)2} 원형질체 분리에 미치는 삼투조절물질 의 농도, 고추의 원형질체 분리에 적합한 효소농도와 함께 고 추 원형질체의 배 양조건을 확립하고자 수행하였다.
제안 방법
- 삼투조절 물질의 농도가 원형질체 수량에 직접적인 영향을 줄 뿐만 아니라, 효소의 종류 및 농도 역시 원형질체의 생산량에 영향을 주는 중요한 요인 중의 하나이다. 고추 원형 질체 분리에 적합한 삼투조절 물질의 농도를 알아보기 위하여 삼투조절 물질 중의 하나인 sorbitol을 0.4~0.7 M로 처리 하였는데 C. anuumm, C. bacatuum, C. 에서 원형 질체 생산량 차이가 있었다. C.
- 삼투 조절제와 효소의 농도 및 종류가 원형질체의 분리에 미치는 영향을 알아보기 위하여 삼투조절제로 sorbitol을 0.4 ~0.7 KU) 범위로 처리하였으며, 효소 농도는 Cellulysin Onozuka R-10을 1%로 고정시킨 후 Macerozyme OnozukaR-10의 농도를 0.1 ~0.5%로 하여 처리하였다. 하배축, 자엽과 잎들을 전처리 용액 (0.
- 액을 15 mL 원심분리 tube에 옮기고 800 rpm에서 10 분 동안 원심분리시킨 후 원심분리 tube 상층의 원형질체 띠 부분을 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 분리하여 새로운 원심 분리 tube에 옮기고 다시 원형질체 세척용액으로 현탁시켜 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고 가라앉은 부분 을 배양배지로 현탁시켜 혈구계산기로 원형질체 수를 조사하였다.
- 원형질체 배양은 초기 액체배양에서 활발한 세포분열을 유 기시킨 다음 액체배지에 정기적으로 신선한 배지를 넣어주는 방법과 분열하고 있는 세포들을 agarose 반고체 배지에 고정 하여 배양하는 방법을 비교하여 수행하였다. 두 가지 방법을 비교하여 본 결과 신선한 배지를 첨가해 줌으로써 세포의 갈 변을 어느 정도 억제할 수는 있었으나 배지를 교체해 주는 과정에서 원형질체가 파괴되거나 분열이 중지되면서 세포가 갈변되는 현상을 관찰할 수 있었을 뿐만 아니라 형성된 세포 colony의 생장도 느렸다.
대상 데이터
- (주)농우 바이오에서 분양 받은 C. anuumrn (NW800, NW482), C. bacatuum (NW1898), C. chacoense (NW 1900)<공시재료로 하였다. 종자들은 70% 에탄올로 1분 동안 흔들어 주면서 소독한 다음 50% 유한락스 (물 : 유한락스 1 : 1)로 흔 들어 주면서 15분 동안 표면살균하였다.
- 고주 C. anuumm, C. bacatuum, C. chacoensee\ 하배축,자엽 및 본엽을 원형질체 분리재료로 하여 실험한 결과, 원형 질체 분리를 위해서 세포벽 분해효소로 1% Cellulysin과 0.25% Macerozyme 효소의 조합과 삼투조절제로 0.65 M sorbitol을 사용하였다. 항산화제인 MES를 효소용액에 첨가 하여 줌으로써 원형질체 분리과정에서 발생하는 갈변을 억제 시킬 수 있었다.
- 원형질체는 2, 4-D, NAA, TDZ, zeatin, IAA가 첨가된 수 정된 k8p배지 (Glimelius et al. 1986)에서 최종농도가 5x10, protoplast/ml가 되게 희석하여 25℃ 암상태에서 배양하였다.
- 다음 멸균수로 3~5 회 세척하고 멸균된 petridish에서 최아시켰다. 최아시킨 종자들을 3% sucrose가 포함된 MS (Murashige and Skoog1962) 기본배지에서 무균발아시켜 7~10일 성장한 식물체의 하배축과 자엽, 그리고 기내에서 3~4주 성장한 식물체로부터 절취한 잎을 실험재료로 이용하였다.
성능/효과
- 에서 원형 질체 생산량 차이가 있었다. C. amwm (NW800)의 원형질 체 생산량은 야생종인 C. bacatuum (NW1898)과 C. chacoense (NW1900) 그리고 같은 C. anuummNW482에 비하여 뚜렷하게 높았으나 전체적인 경향으로 보아 원형질체 분리 에서 가장 적합한 삼투조절제의 농도는 0.65 M로 나타났다 (Figure 1).
- 배양에서 얻어진 4000여 개의 캘러스를 zeatin, TDZ :IAA 조합으로 한 재분화 배지에 옮겼다. IAA를 1 mg/L로 고정하고 TDZ를 0.01 ~0.05 mg/L의 농도로 처리하였을 때 TDZ의 농도가 높아질수록 NW800 캘러스는 연황색에서 점점 갈색 으로 변하면서 캘러스의 크기도 점점 작아졌으며, NW1898 색깔은 모두 갈색을 띠면서 캘러스의 크기도 별 차이가 없었다. 같은 호르몬 조합에 2 mg/L의 zeatin을 첨가하여 배 양하 였을 때 NW800 캘러스는 TDZ의 농도가 높아질수록 캘러스 크기가 커지면서 연황색으로부터 녹색이 짙어지다가 TDZ 농도가 0.
- 원형질체 배양은 초기 액체배양에서 활발한 세포분열을 유 기시킨 다음 액체배지에 정기적으로 신선한 배지를 넣어주는 방법과 분열하고 있는 세포들을 agarose 반고체 배지에 고정 하여 배양하는 방법을 비교하여 수행하였다. 두 가지 방법을 비교하여 본 결과 신선한 배지를 첨가해 줌으로써 세포의 갈 변을 어느 정도 억제할 수는 있었으나 배지를 교체해 주는 과정에서 원형질체가 파괴되거나 분열이 중지되면서 세포가 갈변되는 현상을 관찰할 수 있었을 뿐만 아니라 형성된 세포 colony의 생장도 느렸다. Agarose가 첨가된 반고체 배지에 고정하여 배양한 세포들은 세포생장이 액체에서보다 빨랐으며 (Figure 3C, 3D), 세포가 갈변되는 현상도 액체평판배지보다 효과적이었는데 (Figure 3E, 3F), 이것은 세포들이 agarosegel에 둘러싸여 있기에 세포들 사이의 물질 유동이 상대적으로 적어지면서 파괴된 세포 혹은 세포 자체에서 분비되는 페 놀물질들이 인근세포와의 직접적인 접촉을 막아주기 때문인 것으로 사료된다.
- baccatuum 계통인 NW1898은 zeatin배지에서 캘러스들은 연 황색을 띠었고 캘러스도 TDZ배지에서 배양한 것보다 컸다. 또한 zeatin 배지에 TDZ를 0.2 mg/L 로 고정하여 첨가한 배지에 캘러스들을 치상하였을 때 NW 800은 전부 녹색으로 생장이 아주 좋았으나 기관형성이 관찰되지 않았으며 NW1898은 TDZ를 첨가한 것과 첨가하지 않은 배지에서 캘러스의 생장이 별 차이가 없음을 관찰하였다.이외에도 2ip, BAP, NAA 등 생장조절제들을 여러가지 농도로 조합하여 캘러스에서 식물체 재분화를 유도하려고 시도 하였으나 (결과 생략) 대부분 위의 결과와 비슷하게 캘러스가 커지기만 하거나 고사하는 현상이 관찰되었다.
- 본 실험에서는 Macerozyme의 농도가 높아지면 원형질체 의 수량이 적어지는 경향이 있었으며 Macerozyme 0.25%가 고추 원형질체 분리에 적합한 것으로 나타났다 (Figure 2).
- 본 실험에서는 자엽과 하배축이 어린잎을 사용하였을 때보다 더 많은 양인 2xl06protoplasts/g 원형질체를 얻을 수 있었다. Prakash 등도 (1997) 고추의 Capsicum annuum L.
- 5 mg/L TDZ, 1 mg/L 2, 4-D를첨가하여 배양하였을 때 5일에 분열을 시작하였으며 원형질 체에서 얻어진 colony들을 agarose가 첨가된 반고체 배지에 고정하여 배양하는 방법이 액체평판배양 방법보다 더 효과적 이었으며 이 방법은 세포배양시 분비되는 페놀류 물질로 인흔 갈변을 방지할 수 있었다. 세 가지 다른 고추속의 원형질 채 배양에서 얻어진 4000여 개의 캘러스를 식물생장조절제인TDZ, IAA, 2ip, BAP, NAA, zeatin을 이용한 100가지 다양한 조합의 재분화 배지에 옮겼으나 캘러스가 커지거나 고사 하는 현상만 관찰되었을 뿐 줄기로 재분화된 식물체는 얻을 수 없었다.
- 항산화제인 MES를 효소용액에 첨가 하여 줌으로써 원형질체 분리과정에서 발생하는 갈변을 억제 시킬 수 있었다. 원형질체를 수정된 K8p 배지에 1~5mg/Lzeatin, 0.5 mg/L IAA, 0.1 ~0.5 mg/L TDZ, 1 mg/L 2, 4-D를첨가하여 배양하였을 때 5일에 분열을 시작하였으며 원형질 체에서 얻어진 colony들을 agarose가 첨가된 반고체 배지에 고정하여 배양하는 방법이 액체평판배양 방법보다 더 효과적 이었으며 이 방법은 세포배양시 분비되는 페놀류 물질로 인흔 갈변을 방지할 수 있었다. 세 가지 다른 고추속의 원형질 채 배양에서 얻어진 4000여 개의 캘러스를 식물생장조절제인TDZ, IAA, 2ip, BAP, NAA, zeatin을 이용한 100가지 다양한 조합의 재분화 배지에 옮겼으나 캘러스가 커지거나 고사 하는 현상만 관찰되었을 뿐 줄기로 재분화된 식물체는 얻을 수 없었다.
- 이와 달리 zeatin을 0.1~0.5mg/L의 농도의 배지에서 캘 러스를 배양하였을 때 NW800 (C. annuum) 의 캘러스들은거의 연황색을 띠었고 크기도 별다른 차이가 없이 비교적 일정하였으며 야생종 C. baccatuum 계통인 NW1898은 zeatin배지에서 캘러스들은 연 황색을 띠었고 캘러스도 TDZ배지에서 배양한 것보다 컸다. 또한 zeatin 배지에 TDZ를 0.
- 2 mg/L 로 고정하여 첨가한 배지에 캘러스들을 치상하였을 때 NW 800은 전부 녹색으로 생장이 아주 좋았으나 기관형성이 관찰되지 않았으며 NW1898은 TDZ를 첨가한 것과 첨가하지 않은 배지에서 캘러스의 생장이 별 차이가 없음을 관찰하였다.이외에도 2ip, BAP, NAA 등 생장조절제들을 여러가지 농도로 조합하여 캘러스에서 식물체 재분화를 유도하려고 시도 하였으나 (결과 생략) 대부분 위의 결과와 비슷하게 캘러스가 커지기만 하거나 고사하는 현상이 관찰되었다.
- 65 M sorbitol을 사용하였다. 항산화제인 MES를 효소용액에 첨가 하여 줌으로써 원형질체 분리과정에서 발생하는 갈변을 억제 시킬 수 있었다. 원형질체를 수정된 K8p 배지에 1~5mg/Lzeatin, 0.
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