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문제 정의
- 따라서 형질전환되지 않은 조직이나 세포에서 줄기가 발생할 위험은 언제나 존재하므로 각 부위별 반응을 비교하여 적정조직, 적정 농도를 구명한다는 것은 새로운 식물시스템을 이용할 경우 필수적으로 수행되어야 할 실험이다. 본 실험에서는 먼저 확립된 형질전환체를 이용하여 조직별로 각 항생제에 대하여 어느 정도의 내성을 보이는지 비교하고 형질전환 시 선발 대상인 세포 수준의 반응과 형질전환체의 조직으로서의 반응의 차이를 확인하고자 하였다.
- 본 실험은 II 및 hpt 유전자가 삽입된 현사시나무를 이용하여 각 항생제 저항성 유전자로 형질전환된 세포의 효율적인 선발 조건을 규명하기 위하여 수행되었다. 액아가 포함된 줄기 절편과 잎 절편 조직의 생장, 발근유도, 캘러스 유도로 항생제에 대한감수성에 대한 효과를 검정하였다.
제안 방법
- 선발 조건을 규명하기 위하여 수행되었다. 액아가 포함된 줄기 절편과 잎 절편 조직의 생장, 발근유도, 캘러스 유도로 항생제에 대한감수성에 대한 효과를 검정하였다. 형질 전환되지 않은 대조식물체의 잎 절편을 이용한 경우 50 mg/L의 kanamycin이나 2 mg/L hygromycin으로 캘러스유도 및 생장을 억제할 수 있었으나 형질전환된 식물은 100 mg/L kanamycin, 50 mgJ hygromycin에서도 왕성한 생장을 나타냈다.
- 1996). 전 실험과 정 동안 배양환경은 온도는 25±2℃, 빛은 백색 형광등으로 광도 30 Hmol m%'으로 16시간 명 배양으로 3주간의 생장을 조사하였다.
- 캘러스유도배지 (CIM)는 MS (Murashige and Skoog 1962)를 기 본배지로 BA 0.01 mgL NAA 0.1 mg/L, 2, 4-D 1.0 m0L를 첨가하여 사용하였고 줄기 유도 배지 (SIM)는WPM (Lloyd and McCown 1981)에 1.0 mg/L zeatin, 0.1 mg/L, BA 0.01 mg/L NAA 0.01 mg/를 첨가하였으며, 뿌리 유도 배지 (RIM)는 GD (Gresshoff and Doy 1972)에 IBA 0.2mgJ를 첨가한 것을 사용하였다.
- 각 선발 물질에 대한 엽절편과 절간 조직의 발근능력, 액아 생장, 캘러스유도 및 생장을 조사하였다. 각 부위별 항생제에 대한 감수성 조사를 위하여 항생제는 kanamycin과 hygromycin 을 사용하였으며 kanamycine 0, 10, 50, 100, 500 m0L로 hygromycine 0, 2, 5, 10, 50 mg/L로 처리하였다.
- 캘러스유도 및 생장을 조사하였다. 각 부위별 항생제에 대한 감수성 조사를 위하여 항생제는 kanamycin과 hygromycin 을 사용하였으며 kanamycine 0, 10, 50, 100, 500 m0L로 hygromycine 0, 2, 5, 10, 50 mg/L로 처리하였다.
대상 데이터
- 십.입된 형질전환 현사시나무(P. albaXP. glandu-Zosa)를 실험 재료로 사용하였다. nptJl 유전자 형질전환체는binary vector pBI121 (Jefferson et al.
- glandu-Zosa)를 실험 재료로 사용하였다. nptJl 유전자 형질전환체는binary vector pBI121 (Jefferson et al. 1987)을 A. tumefaciens LBA4404를 이용하여 삽입시킨 것으로 50 mg/L의 kanamycin을 사용하여 선발하였다. hpt 유전자 삽입 형질전환체는 pBIB-HYG (Beckker 1990)를 이용한 것으로 2 mg/L 의 hygromycin을 사용하여 선발한 것이었다 (Noh et al.
성능/효과
- figure 3과 같다. hpt 유전자가 삽입된 형질 전환 체는 처리된 최고 농도인 50 mg/L의 hygromycin에서도 왕성한 캘러스 형성과 생장을 보인 반면 대조식물체는 가장 낮은 농도인 2 mg/L에서만 아주 미미한 캘러스 형성을 보여 hpt 유전자가 npt][ 유전자보다 더 강력한 선발 표지임을 확인할 수 있었다 (Figure 1-B).형질전환체의 경우 50 mg/L hygromycin을 처리한 경우에도 활발한 캘러스 형성과 생장이 관찰되었다.
- 대조식물체와 비교할 때 npt][ 형질전환체가 kanamycin에대한 저항성을 나타내는 것보다 hpt 형질 전환체의 조직이 더 hygromycin에 대한저항성이 강하다는 것이 확인되어 kanamycin보다 hygromycin 이 더 확실한 선발 표지임을 확인하였다. Monika 등(1991)도 콩의 형질전환에서 hygromycin을 이용하여 선발할 경우가 kanamycin> 선발제로 사용할 경우보다 더 효율적인 선발을 할 수 있다고 보고하고 있다.
- Kanamycin이 액아가 포함된 줄기 조직에서 개아 및 생장에 미치는 영향을 조사한 결과, 대조식물체는 kanamycin 100 mg/L농도까지에서 개아 되었으나 형질전환체는 500 mg/l 에서도 개아되고 줄기도 생장하였다. 그러나 대조식물체의 액아가 100 mg/l 라는 고농도의 kanamycin배지에서 정상적으로 개 아는 되었다고 하지만 잎과 줄기는 황색을 띠고 있었다.
- 따라서 이러한 액아를 이용한 선발은 더 높은 농도의 처리나 본 실험의 3주보다 훨씬 더 긴 기간 동안 조사가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 본 실험 결과 액아가 포함된 절간 조직을 이용할 경우 줄기 생장 배지보다는 캘러스 유도 배지를 이용하여야 더 정확한 진단을 할 수 있음이 확인되었다.
- 줄기의 길이를 측정한 결과 3주 배양 기간 동안 kanamycin 100 mg/l까지는 대조식물체의 줄기 생장에 별 영향을 주지는 않았지만 figure 1-C에서 보여주는 것과 같이 농도가 500 mgJ의 고농도에서는 npt][ 형질전환체가 나은 것을 확인할 수 있었다. 그러나 100 mg/L까지는 별 차이가 없이 나타나고 있는데 이는 세포분열의 결과가 아닌 세포 확장의 결과로 해석된다.
- 따라서 hygromycin이 캘러스 유도 및 생장 억제뿐만 아니라 액아 발생 억제에서도 kanamycin보다 훨씬 강력하다는 것을 보여준다. 또한 엽절편과 비교할 때 줄기의 액아가 역시 항생제에 강하다는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 hygromycin이 캘러스 유도 및 생장 억제뿐만 아니라 액아 발생 억제에서도 kanamycin보다 훨씬 강력하다는 것을 보여준다. 또한 엽절편과 비교할 때 줄기의 액아가 역시 항생제에 강하다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 항생제들이 배지에서 줄기 조직을 거쳐서 액아에 이르는 동안 조직과 세포 내의 여러 물질과 반응하거나 부착되어 이동이 느려지거나 희석되기 때문으로 생각된다.
- 그러나 이러한 효과는 시간이 지날수록 없어지기 때문에 배양기간이 충분할 경우 형질 전환되지 않는 세포나 조직은 도태될 것으로 생각된다. 줄기의 길이생장도 대조식물체보다 hpt 형질전환체 가 더 좋은 것으로 나타났다 (Figure 1-D). 두 항생제의 액아생장에 대한효과를 비교한 결과 kanamycine 그 효과가 hygromycin에비해 반복성이 떨어지고 있는 것이 확인되었다.
- 줄기의 길이생장도 대조식물체보다 hpt 형질전환체 가 더 좋은 것으로 나타났다 (Figure 1-D). 두 항생제의 액아생장에 대한효과를 비교한 결과 kanamycine 그 효과가 hygromycin에비해 반복성이 떨어지고 있는 것이 확인되었다.
- Kanamycin 첨가배지에서 3주간 생장시킨 대조 식물체의 줄기조직은 kanamycin 10 mg/L의 농도까지는 뿌리가 발생되 X만 50mg/L에서는 억제되는 것을 볼 수 있었으며 nptH 형질전환체는 100mmg/L 의 kanamycin에서도 발근이 되는 것을 확인할 수 있었다 (Data not shown). 이미 형성되어 있던 눈이 확장되어 터지는 액아생장과는 달리 뿌리 형성은 새로운 세포분열이 선결 요건이므로 여기에는 항생제에 대한 내성이 생장의 중요한 관문이라고 할 수 있다.
- 뿌리의 길이생장에 대한 kanamycin과 hygromycin의 효과를 비교한 결과 hygromycin이 kanamycin보다 훨씬 더 효율적으로 작용하는 것을 확인하였다. Figure 6은 hygromycin 과 kanamycin 이 모두 꾸준함을 보이기는 하지만 hygromycin 은 낮은 농도에서도 선발 표지로서 더 효과적으로 작용함을 나타내고 있다.
- 저농도를 사용할 경우 신뢰할 수 없음이 확인되었고 액아를 이용한 형질전환은 선발의 한계 때문에 효율이 매우 낮을 것으로 생각된다.
- 형질 전환되지 않은 대조식물체의 잎 절편을 이용한 경우 50 mg/L의 kanamycin이나 2 mg/L hygromycin으로 캘러스유도 및 생장을 억제할 수 있었으나 형질전환된 식물은 100 mg/L kanamycin, 50 mgJ hygromycin에서도 왕성한 생장을 나타냈다. 절간 조직의 개아의 경우 100 mg/L kanamycin, 5 mgeL hygromycin으로 줄기 신장을 완전히 억제 가능하였으며, 뿌리 유도는 50 neL kanamycin, 5 neL hygromycin에서 선발이 가능하였다. 형질전환체는 모두 이보다 높은 농도에서 왕성한 생장을 보였다.
- 형질전환체는 모두 이보다 높은 농도에서 왕성한 생장을 보였다. 형질전환이 되지 않은 세포의 생장을 억제히는 데는 hygromycin이 kanamycin보다 더 효율이 좋은 것으로 나타났다. 따라서 hpt 유전자가 nptH 유전자보다 훨씬 강력한 선발 표지임이 확인되었으며 엽절편의 캘러스 유도와 생장과 절간 조직의 발근유도 모두 항생제에 예민하게 작용하여 형질전환체의 식별에 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
- 형질전환이 되지 않은 세포의 생장을 억제히는 데는 hygromycin이 kanamycin보다 더 효율이 좋은 것으로 나타났다. 따라서 hpt 유전자가 nptH 유전자보다 훨씬 강력한 선발 표지임이 확인되었으며 엽절편의 캘러스 유도와 생장과 절간 조직의 발근유도 모두 항생제에 예민하게 작용하여 형질전환체의 식별에 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- (Feldmann and Marks 1987). 따라서 이러한 액아를 이용한 선발은 더 높은 농도의 처리나 본 실험의 3주보다 훨씬 더 긴 기간 동안 조사가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 본 실험 결과 액아가 포함된 절간 조직을 이용할 경우 줄기 생장 배지보다는 캘러스 유도 배지를 이용하여야 더 정확한 진단을 할 수 있음이 확인되었다.
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