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문제 정의
- 본 연구는 기내에서 배양 중인 담배의 약과 캘러스, 그리고 종자에 중이온(l4N, 20Ne) beam을 조사하여 피조사체의 발아, 생장, 형태적 변화를 정상 식물체와 비교하여 돌연 변이 육종의 기초 자료를 얻는 데 목적을 두고 있다.
제안 방법
- 중이온 beam을 조사하기 위한 약의 준비는 담배식물체를 수경재배 하여 크기가 일정한 재료를 다량으로 채취하였다. 예비실험을 통하여 재분화가 양호했던 꽃봉오리의 크기가 12~15 mm의 것을 2% calcium hypochlorite 용액에서 10분간 침적한 다음 멸균수로 4회 세척하였다 표면 소독한 화아에서 분리한 약은 2 mg/L IAA 와 1 mg/L kinetin 및 30 g/L su-crose와 0.
- 채취하였다. 예비실험을 통하여 재분화가 양호했던 꽃봉오리의 크기가 12~15 mm의 것을 2% calcium hypochlorite 용액에서 10분간 침적한 다음 멸균수로 4회 세척하였다 표면 소독한 화아에서 분리한 약은 2 mg/L IAA 와 1 mg/L kinetin 및 30 g/L su-crose와 0.6% 한천이 첨가된 Nakata and Kurihara(1972) 배지에 20개씩 3반복으로 치상, 직경 6cm, 높이 0.6 cm의 사례에서 10일간 배양한 후 중이온 beam을 조사하였다(Hasegawa et al. 1995; Oh et al. 1994).
- 캘러스는 기내에서 발아 후 5주째인 식물체 잎을 5㎟로 절단하여, 1.0 mg/L NAA와 0.1 mg/L BAP가 함께 첨가된 MS 배지(Murashige and Skoog 1962)에 배양하여 캘러스를 유도하였다. 중이온 beam을 조사하기 위하여 캘러스를 4주 간격으로 2회 계대배양 하고 beam 조사 1주일 전에 새로운배지에 이식하였다.
- 중이온 beam을 조사하기 위하여 캘러스를 4주 간격으로 2회 계대배양 하고 beam 조사 1주일 전에 새로운배지에 이식하였다. 캘러스 치상은 직경 9 cm, 높이 1.5 cm의 사례 1개 당 직경 0.6〜0.8 cm의 캘러스를 16개씩 치상하고 3반복 처리하였다.
- 종자에 중이온 beam을 조사하기 위하여 성숙 후 1개월 간건조시키고 4℃에서 일주일간 저온처리한 당해 연도의 종자를 beam 조사 약 24시간 전에 수분을 흡수시킨 종자와 흡수시키지 않는 종자로 구분하여 각각 사용하였다. 파종은 1.
- 않는 종자로 구분하여 각각 사용하였다. 파종은 1.5% sugar, 0.8% 한천을 각각 포함한 1/2 MS 배지를 분주한 샤레 1개 당 100립씩 치상 하였다. 배양은 25±1℃의 80μmol·m-2·s-1의 명조건 하에서 행하였다.
- 일본 이화학연구소(和光)의 ring cycrotron 시설(RRC)을 이용하여 배양 중인 약과 캘러스, 그리고 종자에 14N과 20Ne(135 MeV/u) 이온 beam을 각각 조사하였다. 중이온 beam의 처리시간 및 조사 강도의 설정은 본 연구진이 이미 발표한 실험 결과(Abe et al.
- 1996, 1998)를 참고로 하여 행하였다. 약 조사는 14N과 20Ne (135 MeV/u) 이온 beam을 0, 10, 20, 50, 100 Gy로, 캘러스 조사는 0, 5, 10, 20, 50 Gy로, 종자는 0, 5, 10, 20, 50, 100, 또는 200 Gy로 하였다. 중이온 beam을 조사한 식물체는 25土 1℃의 배양실에서 80μmol·m-2·s-1 광하에서 배양하였다.
- 약에 미치는 중이온 beam의 영향은 중이온 beam을 조사한 후 30일째의 약으로부터 신초와 캘러스가 형성된 개체수를 조사하였다. 캘러스에 대한 영향은 중이온 beam을 조사한 후 1주일 간격으로 캘러스의 생중량을 조사하여 14일 후 상대 생장율을 구하였다.
- 조사하였다. 캘러스에 대한 영향은 중이온 beam을 조사한 후 1주일 간격으로 캘러스의 생중량을 조사하여 14일 후 상대 생장율을 구하였다. 종자는 자엽이 전개한 것을 발아로 간주하여 중이온 beam을 조사한 후 2.
- 캘러스에 대한 영향은 중이온 beam을 조사한 후 1주일 간격으로 캘러스의 생중량을 조사하여 14일 후 상대 생장율을 구하였다. 종자는 자엽이 전개한 것을 발아로 간주하여 중이온 beam을 조사한 후 2.5일 간격으로 발아율을 조사하였다. 초기 생장은 중이온 beam을 조사하여 발아한 유식물체의 근장, 신초장, 엽수를 파종 후부터 7일 간격으로 조사하였다.
- 5일 간격으로 발아율을 조사하였다. 초기 생장은 중이온 beam을 조사하여 발아한 유식물체의 근장, 신초장, 엽수를 파종 후부터 7일 간격으로 조사하였다. 건조종자에 미치는 중이온 beam의 영향을 조사하기 위해서, 중이온 beam을 조사한 종자를 여과지 상에서 발아시킨 경우, 조사 후 1주일째 50 Gy 이상의 선량에서 종자발아가 전혀 관찰되지 않고 여과지 내 환경이 불안정하여 식물체가 쉽게 고사하여 초기생장까지 관찰하기가 어려웠으므로 (Figure 2D), 50 Gy 이상의 선량에서도 백체가 출현하여 발아 후의 생장 특성까지도 효과적으로 조사할 수 있는 기내 배양 방법을 사용하여(Figure 2E) 피조사체들의 특성을 조사하였다.
- 초기 생장은 중이온 beam을 조사하여 발아한 유식물체의 근장, 신초장, 엽수를 파종 후부터 7일 간격으로 조사하였다. 건조종자에 미치는 중이온 beam의 영향을 조사하기 위해서, 중이온 beam을 조사한 종자를 여과지 상에서 발아시킨 경우, 조사 후 1주일째 50 Gy 이상의 선량에서 종자발아가 전혀 관찰되지 않고 여과지 내 환경이 불안정하여 식물체가 쉽게 고사하여 초기생장까지 관찰하기가 어려웠으므로 (Figure 2D), 50 Gy 이상의 선량에서도 백체가 출현하여 발아 후의 생장 특성까지도 효과적으로 조사할 수 있는 기내 배양 방법을 사용하여(Figure 2E) 피조사체들의 특성을 조사하였다.
- 계대배양 후 7일째의 캘러스에 14N과 20Ne 이온 beam을 0 〜50 Gy까지 각각 조사한 후 7일째와 14일째의 생중량을 조사하였다(Table 1). 14N와 20Ne 이온 beam 모두 선량이 증가 할수록 정상주에 비하여 캘러스의 상대 생장율(RGR)이 감소하였으며, 선량의 종류에 따른 상대 생장율의 감소폭도 비슷한 경향으로 나타났다.
- 종자에 수분 처리 여부에 따른 중이온 beam의 영향을 조사하기 위해 먼저 중이온 beam을 조사하기 전에 수분을 처리하지 않고 beam 을 조사하여 종자의 발아 및 초기생장을 검토하였다. 20Ne 이온 beam을 조사한 종자를 기내에 배양한 후 시간의 경과에 따라 발아를 관찰한 결과(Table 2), 20Ne 이온 beam 조사 후 7.
- 배양 중인 담배의 약과 캘러스 그리고 종자에 중이온(14N 또는 20Ne) beam을 조사하여 중이온 beam 조사가 약의 반응, 캘러스의 생장, 종자의 발아와 초기 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 중이온 beam을 조사하기 전 10일간 preculture한 다음 beam을 조사한 약은 14N, 20Ne 모두 20 Gy 이상의선량에서 캘러스 또는 신초유도가 없이 고사하였다.
- 1 mg/L BAP가 함께 첨가된 MS 배지(Murashige and Skoog 1962)에 배양하여 캘러스를 유도하였다. 중이온 beam을 조사하기 위하여 캘러스를 4주 간격으로 2회 계대배양 하고 beam 조사 1주일 전에 새로운배지에 이식하였다. 캘러스 치상은 직경 9 cm, 높이 1.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 식물재료로는 담배(Nicotiana tabacum L.) BY-4 품종의 약, 캘러스, 종자를 각각 사용하였다.
이론/모형
- 중이온 beam의 처리시간 및 조사 강도의 설정은 본 연구진이 이미 발표한 실험 결과(Abe et al. 1996, 1997b; Bae et al. 1996, 1998)를 참고로 하여 행하였다. 약 조사는 14N과 20Ne (135 MeV/u) 이온 beam을 0, 10, 20, 50, 100 Gy로, 캘러스 조사는 0, 5, 10, 20, 50 Gy로, 종자는 0, 5, 10, 20, 50, 100, 또는 200 Gy로 하였다.
성능/효과
- 배양 중인 캘러스는 14N와 20Ne 이온 beam의 조사로 상대 생장율이 감소하였고, 중이온 beam 조사 2주 후부터는 50 Gy 이상 선량 처리구에서 심하게 갈변하였다. 종자에 미치는 중이온 beam 조사의 영향으로 수분을 처리한 후 또는 수분 처리 없이 beam을 조사한 종자 모두에서 선종에 관계없이 선량이 증가함에 따라 발아를 지연시키며 유묘의 초기 생장을 억제하였다. 또한 수분을 흡수시킨 후 중이온 beam을 조사한 경우가 수분을 흡수시키지 않고 beam을 조사한 경우보다 종자의 탈아를 심하게 억제시켰다.
- 본 실험에서 재분화 개체 중 형태 이상을 보인 식물체 빈도가 약 3%로 7선에서 보다 낮게 나타난 것은 관찰 시기가 식물체의 초기 상태였던 점과 조사 항목이 잎의 형태 이상이 큰 개체만을 대상으로 한 결과이기 때문이다. 위의 결과를 종합할 때 담배의 약에는 20 Gy 이하의 저선량의 중이온 beam을 조사함으로써 변이 효율을 증대시킬 것으로 생각된다.
- 14N와 20Ne 이온 beam 모두 선량이 증가 할수록 정상주에 비하여 캘러스의 상대 생장율(RGR)이 감소하였으며, 선량의 종류에 따른 상대 생장율의 감소폭도 비슷한 경향으로 나타났다. 50 Gy 이상의 고선량에서도 캘러스의 생중량은 증가하였으나 중이온 beam을 조사한 후 2주째부터는 갈변하면서 고사하는 캘러스가 나타났다 (Figure 2C).
- 20Ne 이온 beam을 조사한 종자를 기내에 배양한 후 시간의 경과에 따라 발아를 관찰한 결과(Table 2), 20Ne 이온 beam 조사 후 7.5일까지는 조사선 량이 증가할수록 발아율이 감소하였으나, 대조구가 거의 발아하는 10일 이후는 시간이 지날수록 모든 처리구에서 발아율은 대조구와 차이가 없었다. 이는 중이온 beam이 초기에 발아를 지연시키는 것으로 판단되며, 발아 후에도 3주 후 생장을 조사한 결과, 발아지연에 따라 생장도 크게 억제되었다(Figure 3).
- 5일까지는 조사선 량이 증가할수록 발아율이 감소하였으나, 대조구가 거의 발아하는 10일 이후는 시간이 지날수록 모든 처리구에서 발아율은 대조구와 차이가 없었다. 이는 중이온 beam이 초기에 발아를 지연시키는 것으로 판단되며, 발아 후에도 3주 후 생장을 조사한 결과, 발아지연에 따라 생장도 크게 억제되었다(Figure 3). 또한, 14N 이온 beam을 건조 종자에 조사한 경우도 상기의 20Ne 이온 beam 처리구와 유사한 경향을 나타내기 때문에 본 논문의 data로 제시하지 않았다.
- 증이온 beam 조사 24시간 전에 수분을 처리한 종자를 beam을 조사한 후에 시간의 경과에 따라 발아를 관찰한 결 (Table 3, Table 4), 선종에 관계없이 선량이 증가할수록 종자의 발아가 억제되었으며, 중이온 beam을 처리한 후 7.5 일째 20Ne과 14N 이온 beam 조사구 모두 100 Gy 이상의 선량에서는 발아가 전혀 이루어지지 않았다. 특히 20Ne 보다 14N 이온 beam을 100 Gy 이상 조사하였을 때 발아 억제가 심하게 되어 l4N 이온 beam의 처리구에서는 30일 후에도 약 38.
- 5 일째 20Ne과 14N 이온 beam 조사구 모두 100 Gy 이상의 선량에서는 발아가 전혀 이루어지지 않았다. 특히 20Ne 보다 14N 이온 beam을 100 Gy 이상 조사하였을 때 발아 억제가 심하게 되어 l4N 이온 beam의 처리구에서는 30일 후에도 약 38.7%의 발아율만 보여주었다. 이상의 결과를 살펴보면 중이온 beam의 종류 및 선량의 세기에 따라 종자발아에 미치는 영향에 차이가 있었으며, 특히 주목할 것은 수분이 흡수된 종자의 경우 무처리 종자에 비해 중이온 beam에 대한 발아 억제 효과가 큰 것으로 나타났다.
- 7%의 발아율만 보여주었다. 이상의 결과를 살펴보면 중이온 beam의 종류 및 선량의 세기에 따라 종자발아에 미치는 영향에 차이가 있었으며, 특히 주목할 것은 수분이 흡수된 종자의 경우 무처리 종자에 비해 중이온 beam에 대한 발아 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. 이러한 요인에 대해서는 불분명하지만 수분이 흡수된 종자에서 발아에 관련된 생리 활성 물질이 증가하는 시기에 중이온 beam 처리가 매우 민감하게 반응하는 것으로 생각되나 추후 생리화학적 측면에서 보다 많은 검토가 필요하다고 생각된다.
- 이러한 요인에 대해서는 불분명하지만 수분이 흡수된 종자에서 발아에 관련된 생리 활성 물질이 증가하는 시기에 중이온 beam 처리가 매우 민감하게 반응하는 것으로 생각되나 추후 생리화학적 측면에서 보다 많은 검토가 필요하다고 생각된다. 따라서 본 연구 결과를 응용하는 측면에서 수분을 처리한 뒤 중이온을 조사하는 방법이 형태변이체 유발에 효과적일 것으로 보인다. 그 외 Shikazono (1998)는 중이온 beam이 선량, 선종, 처리 방법 뿐만 아니라 선에너지부여(linear energy transfer, LET) 량에 따라서도 종자 생존에 차이가 있다고 보고하였기 때문에 추후 LET량에 따른 변이의 검토가 필요하다고 생각한다.
- 유식물체의 초기 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해서 종자에 중이온 beam을 조사한 후 21일째에 개체들의 근장을 관찰한 결과 (Figure 3A, B), 선종 및 수분의 처리 여부에 관계없이 선량이 증가함에 따라 근장은 짧게 나타났다. 수분을 처리한 다음 중이온 beam을 조사한 구에서는 근장이 더욱 심하게 억제되었고(Figure 3A), 수분의 처리 여부에 관계없이 14N보다는 20Ne 이온 beam에서 크게 억제되었다.
- 수분을 처리한 다음 중이온 beam을 조사한 구에서는 근장이 더욱 심하게 억제되었고(Figure 3A), 수분의 처리 여부에 관계없이 14N보다는 20Ne 이온 beam에서 크게 억제되었다. 특히 수분을 처리하여 20Ne 이온 조사시 20 Gy 이상에서는 뿌리 신장이 거의 일어나지 않았다.
- 특히 수분을 처리하여 20Ne 이온 조사시 20 Gy 이상에서는 뿌리 신장이 거의 일어나지 않았다. 또한 신초장도 수분의 처리 여부에 관계없이, 14N 보다는 20Ne 이온 beam에서 크게 억제되고, 선량이 증가함에 따라 감소되어 20Ne 이온 beam 조사시 50 Gy 이상, 14N 이온 beam 조사시 100 Gy 이상 선량에서 심하게 억제되었다(Figure 3C, D). 수분을 처리한 다음 중이온 beam을 조사한 구에서는 신초장이 더욱 억제되었고(Figure 3C), 50 Gy 이상 선량 처리구에서는 선종에 관계없이 시간이 경과함에 따라 유식물체의 생장이 둔화하고 점차 황변하여 고사하였다.
- 수분을 처리한 다음 중이온 beam을 조사한 구에서는 신초장이 더욱 억제되었고(Figure 3C), 50 Gy 이상 선량 처리구에서는 선종에 관계없이 시간이 경과함에 따라 유식물체의 생장이 둔화하고 점차 황변하여 고사하였다. 반면, 자엽을 포함한 엽수는 선종간에 큰 차이가 없이 무처리에서 평균 5매였으나 건조종자에 100 Gy 선량으로 처리한 후 3주째 4매로 감소하였고, 수분을 처리한 후 조사한 구에서는 2.5매로 거의 엽수가 증가하지 않았다. 수 분후 1〜4일이 경과한 후 발생 중인 담배의 배에 조사한 경우에서는 50 Gy 이상의 고선량 처리에서는 발아 후 생장이 되지 않는 개체가 많고 형태적으로는 잎이 심하게 뒤틀린 개체가 유발되었으나 (Abe et al.
- 이상의 결과를 종합하면 담배 BY-4 품종을 이용하여 중이온 beam을 여러 가지 재료에 조사한 결과 식물재료에 따라 조사선량에 대한 감수성이 다양하게 나타났다. 배양 중인 약은 캘러스나 종자에 beam을 조사한 경우보다 낮은 선량에서 고사하였고 조사선량에 대한 감수성이 종자나 캘러스의 경우보다 큰 것으로 나타났다.
- 대한 감수성이 다양하게 나타났다. 배양 중인 약은 캘러스나 종자에 beam을 조사한 경우보다 낮은 선량에서 고사하였고 조사선량에 대한 감수성이 종자나 캘러스의 경우보다 큰 것으로 나타났다. 선종에 따른 영향으로는 14N보다는 20Ne 이온 beam 처리에서 약의 반응과 유식물의 초기 생장을 크게 억제하는 것으로 나타났다.
- 배양 중인 약은 캘러스나 종자에 beam을 조사한 경우보다 낮은 선량에서 고사하였고 조사선량에 대한 감수성이 종자나 캘러스의 경우보다 큰 것으로 나타났다. 선종에 따른 영향으로는 14N보다는 20Ne 이온 beam 처리에서 약의 반응과 유식물의 초기 생장을 크게 억제하는 것으로 나타났다. 그러나, 종자에 100 Gy 이상 고선량 처리시에는 14N가 20Ne 이온보다 발아를 억제하는 효과가 컸다.
- 선종에 따른 영향으로는 14N보다는 20Ne 이온 beam 처리에서 약의 반응과 유식물의 초기 생장을 크게 억제하는 것으로 나타났다. 그러나, 종자에 100 Gy 이상 고선량 처리시에는 14N가 20Ne 이온보다 발아를 억제하는 효과가 컸다. 본 연구에서 특기할만한 형태변이 식물체로는 l4N 이온 beam을 조사한 처리구에서 다엽이 발생하는 변이체(Figure 2B)와 화기가 다수 발생하는 변이체, 그 밖에도 4일간 배양한 후 5 Gy의 중이온 beam을 조사한 처리구에서는 안토시아닌 결핍을 보이는 화색 변이체가 유발되었다.
- 그러나, 종자에 100 Gy 이상 고선량 처리시에는 14N가 20Ne 이온보다 발아를 억제하는 효과가 컸다. 본 연구에서 특기할만한 형태변이 식물체로는 l4N 이온 beam을 조사한 처리구에서 다엽이 발생하는 변이체(Figure 2B)와 화기가 다수 발생하는 변이체, 그 밖에도 4일간 배양한 후 5 Gy의 중이온 beam을 조사한 처리구에서는 안토시아닌 결핍을 보이는 화색 변이체가 유발되었다. 이러한 변이체는 식물분자생물학의 발전에 따른 기능 유전자의 해석에 필요한 연구재료로서 매우 유익하게 활용될 수 있으며, 육종의 소재로 사용하는데도 유용하기 때문에 중이온 beam을 이용한 돌연변이 식물체 개발에 대한 효과가 기대된다.
- 또한 수분을 흡수시킨 후 중이온 beam을 조사한 경우가 수분을 흡수시키지 않고 beam을 조사한 경우보다 종자의 탈아를 심하게 억제시켰다. 건조 상태의 종자에 중이온 beam을 조사한 경우 피조사체들의 특성과 생장의 초기 단계에서 형태적 변이체를 검토하는데는 여과지를 이용한 방법보다 기니에서 배양하는 방법이 보다 효과적이었다.
후속연구
- 1999)과 비교할 때, 본연구에서 중이온 beam을 5〜 20 Gy 처리시에도 상대생장율이 감소한 것 (Table 1)은 식물종에 따른 감수성의 차이이거나 돌연변이 원에 따른 차이로 생각된다. 상기의 결과로부터 캘러스를 이용한 변이체를 개발하기 위해서는 이미 세포배양 중 일어나고 있는 체세포군 변이와 중이온 beam의 선량을 최적화시킨 돌연변이원을 병행 처리함으로써 효과적으로 변이체를 선발할 수 있다고본다.
- 이상의 결과를 살펴보면 중이온 beam의 종류 및 선량의 세기에 따라 종자발아에 미치는 영향에 차이가 있었으며, 특히 주목할 것은 수분이 흡수된 종자의 경우 무처리 종자에 비해 중이온 beam에 대한 발아 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. 이러한 요인에 대해서는 불분명하지만 수분이 흡수된 종자에서 발아에 관련된 생리 활성 물질이 증가하는 시기에 중이온 beam 처리가 매우 민감하게 반응하는 것으로 생각되나 추후 생리화학적 측면에서 보다 많은 검토가 필요하다고 생각된다. 따라서 본 연구 결과를 응용하는 측면에서 수분을 처리한 뒤 중이온을 조사하는 방법이 형태변이체 유발에 효과적일 것으로 보인다.
- 본 연구에서 특기할만한 형태변이 식물체로는 l4N 이온 beam을 조사한 처리구에서 다엽이 발생하는 변이체(Figure 2B)와 화기가 다수 발생하는 변이체, 그 밖에도 4일간 배양한 후 5 Gy의 중이온 beam을 조사한 처리구에서는 안토시아닌 결핍을 보이는 화색 변이체가 유발되었다. 이러한 변이체는 식물분자생물학의 발전에 따른 기능 유전자의 해석에 필요한 연구재료로서 매우 유익하게 활용될 수 있으며, 육종의 소재로 사용하는데도 유용하기 때문에 중이온 beam을 이용한 돌연변이 식물체 개발에 대한 효과가 기대된다.
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