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문제 정의
- 본 연구에서는 이전 연구를 바탕으로2627 국소 부위에서 영차로 약물을 방출할 수 있는 서방성 약물 방출 제형을 제조하는데 목적을 두었고, 방출 시간에 따른 적절한 제형을 선택하기 위해 항생제를 함유한 PHBV 필름과 매트릭스로 제형화하여 이들의 두꺼), 약물의 함유량, 공중합체의 조성, 하이드록시프로필셀룰로오스 (HPC) 함량 등이 GS의 방출에 어떠한 영향을 미치는가를 살펴보았다.
제안 방법
- 위의 결과를 통해 제형의 두께를 조절함으로 약물의 방출시간을 조절할 수 있다는 사실을 증명할 수 있다. D300G 와 D400G를 고분자지지체로 사용한 제형에서도 같은 현상을 관찰하였다.
- 첨가제에 따른 방출 경향. D600G와 10% GS (lg 기준)로 이루어진 혼합물에 친수성 고분자인 HPC를 5%와 10% 첨가시 약물의 방출거동에 미치는 영향을 조사하였다 (Figure 11; M10, M14 및 M15). 첨가제를 넣지 않은 제형은 일반적으로 물에 의한 침식과 채널을 통한 확산에 의한 방출을 보인다.
- 제조한 제형의 표면과 내부형태는 전자주사현미경 (SEM, scanning electron microscope, S-2250N, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였다. SEM 사진을 찍7 위하여 양면테이프로 붙인 금속판 위에 충분히 건조한 샘플을 고정시킨 후 플라즈마 스퍼터 (SC 500K, Emscope, UK)를이용하여 아르곤 분위기 하에서 1분 30초 동안 백금으로 코팅하였다. 또한 매트릭스의 단면도를 보기 위해 샘플을 액화질소에 넣어 동결시켜 단면을 얻었다.
- SEM 사진을 찍7 위하여 양면테이프로 붙인 금속판 위에 충분히 건조한 샘플을 고정시킨 후 플라즈마 스퍼터 (SC 500K, Emscope, UK)를이용하여 아르곤 분위기 하에서 1분 30초 동안 백금으로 코팅하였다. 또한 매트릭스의 단면도를 보기 위해 샘플을 액화질소에 넣어 동결시켜 단면을 얻었다. SEM 관찰은 약물방출 전과 후 모두 동일하게 실시하였다.
- 본 실험에서 사용한 고분자인 PHBV는 Figure 1과 3에서와 같이 입체 규칙적이고, HB와 HV의 랜덤한 구조로 이루어져 있다. 또한, PHBV와 약물의 혼합에 따른 결정성을 알아보기 위하여 고분자의 조성 및 GS 함유량과 HPC의 첨가에 따른 결정영역의 변화를 XRD를 이용하여 측정하였다. 그 결과, Figure 2에서와 같이 HV 함량이 5%인 D300G가 가장 결정성이 크게 나타났고, HV 함량이 15%인 D600G와 약물인 GS의 혼합물에 친수성 첨가제인 HPC를 넣음으로 결정성이 감소되는 현상을 관찰할 수 있다.
- 방출된 GS 의 농도를 분석하기 위하여 0- phthaldehyde (OPA)를 첨가하여 15분간 유도과정을 거친 후, HPLC (HP 1100 Series, Hewlett Packard, USA)를 이용하여 분석하였다.8,26) 분석시컬럼은 역상컬럼 (UG 120 5 μm, 4.
- M 일반적으로 생분해성 제형은 고분자 지지체 내에서 약물 확산과 물로 인한 고분자의 침식에 의한 분해의 두 가지 기구에 의해 약물을 방출한다. 본 실험을 통해 제작된 제형에서는 고분자 지지체의 결정성과 다공성이 큰 구조일수록 단순 확산에 의한 약물의 초기 방출량이 증가하는 현상을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 생체적합성과 생분해성을 가진 PHBV를 이용한 용융압축 성형방법을 사용하여 항생제를 서서히 방출하는 생분해성 제형을 제조하였고, 생체 외에서 이들 제형의 방출거동을 관찰하였다. 실험결과와 같이 제조 조건을 달리하여 여러 형태의 방출패턴을 얻을 수가 있었다.
- 고분자의 종류에 따른 방출 경향. 생분해성 고분자인 PHBV를 이용한 항생제 방출 제형에서 고분자의 조성 중 HV의 함량 증가에 따른 방출거동의 변화를 D600G와 10% GS를 함유한 필름 (Figure 9)과 매트릭스 (Figure 10)를 통해 각각 확인하였다. 두 그래프에서 모두 HV의 함량이 증가할수록 초기방출량이 줄어들었고, 방출거동이 선형성을 보임을 알 수 있다.
- 생체외 방출 실험 및 분석. 제조한 제형을 각각 phosphate buffered saline (PBS, pH; 7.
- XRD 측정과 SEM 관찰. 약물과 고분자의 결정성을 알아보기 위해 X-ray diffraction (XRD, D/ MAX in, Rigaku, Japan) 을 이용하여 조사하였다. 분석시 10~50°의 분석각도(20)에서 O.
- 6x150 mm, USA)을 사용하였고, UV 파장은 330nm에서 검출하였다. 이동상은 methanol, distilled water, 이a- cial acetic acid 가 각각 70: 25: 5 vol % 로 구성 되었고, 여기에 5 g의 sodium 1 -heptanesulfonate> 첨가하였다. OPA 유도방법과 HPLC 분석은 USP 에 따라 실시하였다.
- ldeg/min 의 속도로 분석하였다. 제조한 제형의 표면과 내부형태는 전자주사현미경 (SEM, scanning electron microscope, S-2250N, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였다. SEM 사진을 찍7 위하여 양면테이프로 붙인 금속판 위에 충분히 건조한 샘플을 고정시킨 후 플라즈마 스퍼터 (SC 500K, Emscope, UK)를이용하여 아르곤 분위기 하에서 1분 30초 동안 백금으로 코팅하였다.
- GS는 고온, 고압에서도 분해가 되지 않는 안정성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다・的 생성된 용융물은 상온에서 냉각시켜 최종적인 제형을 얻었다. 항생제를 함유한 서방성 제형은 제형의 두께, 초기 약물함유량 및 첨가제의 영향 등을 변수로 하여 제조하였고, 고분자의 종류별 (D300G, D400G 및 D600G)로 각각 3개씩 제조하였다 (Table 1).
대상 데이터
- 0 mm thickness matrix). GS 5% (M12), GS 10% (MIO), and GS 20% (M13).
- Bacterial inhibition zone test with different matrix thickmess (8-day release; 10% GS loading). SH (Standard high; 1 mg/mL), SL (Standard low, OA mg/ mL), 0.1 mm (F2), 0.3mm(M7), 0.9 mm (M8), 1.5 mm (M9), and 3.0 mm (M10).
- 이용하였다. 본 실험에는 영양 육즙 (nutrient broth ; beef extract, peptone, Difco Laboratories, USA)에서 24시간 동안 배양한 황색 포도상구균 (StaDhylococcus aureus ATCC 29737)을 이용하였다. 생체외 방출실험에서 얻어진 용출액은 인산염 완충액을 이용하여 100배 희석한 후에 3 mm cloning disk (Sigma Chem.
- 시약 및 재료. 본 실험에서 사용한 GS는 동신제약에서 제공받았다. PHBV는 미국의 Monsanto Chem.
- 고분자와 약물 혼합물의 물리화학적 특성. 본 실험에서 사용한 고분자인 PHBV는 Figure 1과 3에서와 같이 입체 규칙적이고, HB와 HV의 랜덤한 구조로 이루어져 있다. 또한, PHBV와 약물의 혼합에 따른 결정성을 알아보기 위하여 고분자의 조성 및 GS 함유량과 HPC의 첨가에 따른 결정영역의 변화를 XRD를 이용하여 측정하였다.
- PHBV는 미국의 Monsanto Chem.에서 제공받은 D300G, D400G 및 D600 G이며, hydroxy valerate (HV) 함량은 각각 5, 10 및 15 mol% 이었다. 약물의 방출시간을 조절하기 위해 사용한 첨가제 HPC는 미국의 Aldrich Chem.
- 약물의 방출시간을 조절하기 위해 사용한 첨가제 HPC는 미국의 Aldrich Chem. 에서구입한 것으로, 분자량 1000000 g/mole인 제품을 사용하였다. 그 외 모든 화학약품과 유기용매는 high performance liquid chromatography (HPLC) 등급을 사용하였다.
이론/모형
- GS의 생물학적 활성을 관찰하기 위해 항생제 원판확산법을 이용하였다. 본 실험에는 영양 육즙 (nutrient broth ; beef extract, peptone, Difco Laboratories, USA)에서 24시간 동안 배양한 황색 포도상구균 (StaDhylococcus aureus ATCC 29737)을 이용하였다.
- 이동상은 methanol, distilled water, 이a- cial acetic acid 가 각각 70: 25: 5 vol % 로 구성 되었고, 여기에 5 g의 sodium 1 -heptanesulfonate> 첨가하였다. OPA 유도방법과 HPLC 분석은 USP 에 따라 실시하였다.
- 항생제를 함유한 PHBV 제형의 제조. 본 연구에서는 결정성이 큰 고분자인 PHBV에 수용성인 GS를 함유한 제형을 제조하기 위하여 용융압축 성형 방법을 사용하였다. 먼저, pellet 상태의 고분자를 미세한 분말 형태로 만들기 위해서 PHBV를 액체질소로 동결된 동결분쇄기 (SPEX 6700, Metuchen, USA)를이용하여 10분 동안 분쇄하였다.
성능/효과
- 이에 반해 무정형인 HPC를 첨가하면, 첨가제의 무정영역이 약물을 포접하여 고분자 지지체 내에 조밀하게 밀집시키게 되고, 이로 인해 물에 의한 단순확산 현상을 제어하여 거의 일정한 방출 속도를 나타낼 수 있었다. 5%와 10%의 HPC 함유 제형을 비교하면 HPC를 10% 첨가한 제 형이 약물 방출 속도 지연효과가 큰 현상을 관찰할 수 있다. 따라서, 첨가제의 선택과 이의 함유량을 조절함으로써 제형에서 약물의 방출을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
- Figure 4는 제형의 두께에 따른 GS의 방출거동을 나타낸 것이다. D600G와 10%의 GS로 만들어진 제형에서 필름 (F2)과 매트릭스 (M7~Mil)는 두께가 두꺼워질수록 방출 시간이 5~30일로 점차 증가함을 보였다. 또한, 초기 방출효과도 점차 감소하여 거의 영 차에 가까운 방출을 보임을 관찰하였다.
- 또한, PHBV와 약물의 혼합에 따른 결정성을 알아보기 위하여 고분자의 조성 및 GS 함유량과 HPC의 첨가에 따른 결정영역의 변화를 XRD를 이용하여 측정하였다. 그 결과, Figure 2에서와 같이 HV 함량이 5%인 D300G가 가장 결정성이 크게 나타났고, HV 함량이 15%인 D600G와 약물인 GS의 혼합물에 친수성 첨가제인 HPC를 넣음으로 결정성이 감소되는 현상을 관찰할 수 있다. 약물을 함유한 생분해성 제형에서 이러한 고분자 지지체의 결정영역의 변화는 약물의 포접 및 방출거동에 많은 영향을 미친다.
- 생분해성 고분자인 PHBV를 이용한 항생제 방출 제형에서 고분자의 조성 중 HV의 함량 증가에 따른 방출거동의 변화를 D600G와 10% GS를 함유한 필름 (Figure 9)과 매트릭스 (Figure 10)를 통해 각각 확인하였다. 두 그래프에서 모두 HV의 함량이 증가할수록 초기방출량이 줄어들었고, 방출거동이 선형성을 보임을 알 수 있다. 이는 XRD을 통해 관찰했듯이 고분자 내에 HV의 함량이 증가할수록 결정성이 감소하므로 매트릭스 내에서 약물이 고분자와 더 조밀하게 밀집되었고, 이로 인해 물의 침투로 인한 확산이 제어되어 선형의 방출거동을 보인 것으로 판단된다.
- 이러한 현상은 HV의 함량이 증가할수록, HPC의 첨가량이 증가할수록 감소되었다. 따라서, HV의 함량과 첨가제에 따라서 제형의 구조를 조절한다면, 입자들의 회합 현상을 배제하고 약물이 고분자지지체 내부에 골고루 분산되어 방출속도를 일정하게 제어할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 5%와 10%의 HPC 함유 제형을 비교하면 HPC를 10% 첨가한 제 형이 약물 방출 속도 지연효과가 큰 현상을 관찰할 수 있다. 따라서, 첨가제의 선택과 이의 함유량을 조절함으로써 제형에서 약물의 방출을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.'2
- 일반적으로 제형의 두께가 두꺼워질수록, HV 함량이 증가할수록, 그리고 적절한 초기약물함유량 등의 조건을 조절함으로써 약물은 영차에 가까운 방출을 보였다. 또한, 10% GS와 D600G의 혼합물에 HPC를 첨가함으로 30일 이상 약물을 방출하는 제형을 얻을 수 있었고, 5- 30일 이내에서 원하는 기간 동안 약물을 방출하는 제형을 제조하는 기술도 확립하였다. 이러한 용융압축 성형 방법은 유기용매와 접촉하지 않으므로 미립구 등 용매 증발법을 이용한 제형 제조에 제약이 있는 서방성 방출제제를 제조하는데 유리하고, 첨가제 등을 통해 고분자지지체를 통한 단순 확산에 의한 약물의 초기방출을 제어할 수 있다는 장점을 갖고 있다.
- D600G와 10%의 GS로 만들어진 제형에서 필름 (F2)과 매트릭스 (M7~Mil)는 두께가 두꺼워질수록 방출 시간이 5~30일로 점차 증가함을 보였다. 또한, 초기 방출효과도 점차 감소하여 거의 영 차에 가까운 방출을 보임을 관찰하였다. 이것은 제형의 두께가 두꺼워질수록 용매와 고분자 사이에서 팽윤과 확산에 의한 약물의 방출이 줄어든다는 것을 의미한다.
- 26 이러한 현상은 항균실험 (Figure 5)을 통해 항균 영역의 크기를 측정함으로써 HPLC 분석분과 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 위의 결과를 통해 제형의 두께를 조절함으로 약물의 방출시간을 조절할 수 있다는 사실을 증명할 수 있다. D300G 와 D400G를 고분자지지체로 사용한 제형에서도 같은 현상을 관찰하였다.
- 제형의 내부를 절단한 단면을 살펴보면, 전반적으로 친수성인 약과소수성인 고분자가 서로 잘 결합하지 못하고 덩어리로 뭉쳐있는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 HV의 함량이 증가할수록, HPC의 첨가량이 증가할수록 감소되었다. 따라서, HV의 함량과 첨가제에 따라서 제형의 구조를 조절한다면, 입자들의 회합 현상을 배제하고 약물이 고분자지지체 내부에 골고루 분산되어 방출속도를 일정하게 제어할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 그래프에서와같이 약물을 5% 함유한 제형은 2일 후에 약 12%, 5일 후에는 약 35%의 약물을 초기 방출효과 없이 거의 영차로 20일 동안 지속적으로 방출하였다. 이에 비해 약물을 20% 함유한 제형은 2일 후에는 약 26%,5일 후에는 약 62%의 방출되는 등 초기 방출이 증가함을 관찰하였다. 이는 약물의 함량이 증가하면서 약물 상호간에 접촉할 수 있는 확률이 높아지며, 이들이 서로 채널을 형성하여 수용성 약물이 낮은 함량의 것보다 용이하게 용출되는 것으로 추측된다.
- 방출 전의 사진에서는 매우 둥근 구형의 약물이 고분자 지지체 내부에 일정치 않게 분산되어 있다가 방출이 완료된 후에는 약물이 분포해 있던 공간을 중심으로 구멍이 크게 변해 있음을 관찰할 수 있다. 제형의 내부를 절단한 단면을 살펴보면, 전반적으로 친수성인 약과소수성인 고분자가 서로 잘 결합하지 못하고 덩어리로 뭉쳐있는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 HV의 함량이 증가할수록, HPC의 첨가량이 증가할수록 감소되었다.
후속연구
- 이러한 용융압축 성형 방법은 유기용매와 접촉하지 않으므로 미립구 등 용매 증발법을 이용한 제형 제조에 제약이 있는 서방성 방출제제를 제조하는데 유리하고, 첨가제 등을 통해 고분자지지체를 통한 단순 확산에 의한 약물의 초기방출을 제어할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 이를 기반으로 현재 실험동물을 통한 생체내의 방출 거동실험을 수행중이다.
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