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문제 정의
- 따라서 메트릭스 효과를 최소화할 수 있는 전처리 방법이 선결되어야 한다. 본 실험에서는 microcystin-LR, -YR 및 -RR 등 독성물질을 확인 • 분석하는데 있어 종전의 HPLC/UV 방법 대신, micro-high performance liquid chromatography/ion spray/ mass spectrometry(micro-HPLC/IS/ MS> 적용함으로써 정확성을 부여하고자 하였다.18-26 따라서, microHPLC/IS/MS를 이용하여 microcystin-LR, -YR 및 -RR의 구조적인 특성과 검량선의 직선성을 확인하고, 검토된 조건에서 본 방법을 대청호의 시료 중에 적용하는 일련의 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 500 mg 수체시료를 GF/C로서 여과한 후, 그여액을 MeOH 10mL와 물 10mL로써 전처리한 Water研｝의 C18카트리지 (Oasisg] 10 mL/min 속도로서 흘려 보내면서 흡착시켰다. 10, 20 및 30% MeOH 용액을 각각 10 mL씩 차례로 통과시켜 카트리지 중에 포함된 불순물을 세척한 후, 공기로써 건조시킨 다음, 6mL의 MeOH로 용리 시켰다. 용리액을 turbovap에서 질소로 건조시키고, 잔류분은 100 의 MeOH에 녹여 시료로 하였다.
- 본 실험에서는 microcystin-LR, -YR 및 -RR 등 독성물질을 확인 • 분석하는데 있어 종전의 HPLC/UV 방법 대신, micro-high performance liquid chromatography/ion spray/ mass spectrometry(micro-HPLC/IS/ MS> 적용함으로써 정확성을 부여하고자 하였다.18-26 따라서, microHPLC/IS/MS를 이용하여 microcystin-LR, -YR 및 -RR의 구조적인 특성과 검량선의 직선성을 확인하고, 검토된 조건에서 본 방법을 대청호의 시료 중에 적용하는 일련의 실험을 수행하였다.
- MCST-LR, MCST-YR 및 MCST-RR의 분석. 98년 9월에 채취한 대청댐 시료에서 추출한 조류세포에, Micro-HPLC/IS/MS법을 적용하여 TIC 크로마토그램을 측정하였다. Fig.
- MCST-LR, MCST-YR 및 MCST-RR의 분석. 대청호의 4개 지점에서 채취한 시료들에 대한 기본항목을 분석한 결과 수환경이 대동소이 하였다.
- Micro-HPLC/IS/MS를 이용하여 MCST-LR, MCSTYR, MCST-RR를 각각 확인할 수 있는 구조특성을 찾고자, 이들의 혼합 표준용액 (3 mg/L：号 20 由씩 주입하고, 잡혀진 조건에서 TIC 크로마토그램을 얻었다. 또한 정량에 필요한 검량선을 얻고자, 각 표준용액 1, 3, 5 mg/L에 대한 TIC 크로마토그램의 면적을 적분하였다.
- Micro-high performance liquid chromatography/ion spray/mass spectrometry（Micro-HPLC/IS/MS^r 이용 하여 microcystin 계열의 MCST-LR, MCST-YR 및 MCSTRR 등의 독성물질을 확인 • 분석하는 일련의 실험을 수행하였다. 지금까지 발표된 일련의 연구결과에 의하면 MCST-LR, -YR 및 -RR를 확인하는데 특성 스펙트럼인 135 m2와 [M+H+ 즉, MCSTYR는 1045 m/z, MCSTL際 995 m/z, 그리고 MCST-RR는 1038 m/z 만이 측정되어 분석에 이용하여 왔으나, 본 연구에서는 이것 외에 MCST-YR는 1044+18아모늄 이온）의 이중 전하인 532 m/z, -LR는 994+18（암모늄 이온）의 이중전하인 507 m/z 그리고 -RR는 1038의 이중 전하인 520 m/z 를 찾아내었다.
- 즉, 수온은 현장에서, T-N은 자외선 흡광 광도법으로, T-P은 K2S2O8로서 산화시켜 얻은 정인 산을 phosphomolybdenum blue법으로 또, Chl-a는 아세톤용액으로 클로로필 색소를 추출.농축하여 UV-Vis Sectrophotometer로 측정하였다.
- 기본항목 분석. 대청호의 4개 지점에서 채취한 시료 들의 온도, Total Nitrogen(T-N), Total Phosphorus(T-P) 및 Chlorophyll a(Chl-a厝 수질오염 공정시험방법에 따라 측정하였다. 즉, 수온은 현장에서, T-N은 자외선 흡광 광도법으로, T-P은 K2S2O8로서 산화시켜 얻은 정인 산을 phosphomolybdenum blue법으로 또, Chl-a는 아세톤용액으로 클로로필 색소를 추출.
- 대청호의 4개 지점에서 채취한 시료들에 대한 기본항목을 분석한 결과 수환경이 대동소이 하였다. 따라서 대전 취수탑 앞에서 채취하여 전처리한 조체시료만을 택하여, 기존의 HPLC/U湾을 적용하였고 또 이 시료에 일정량의 MCST-LR, -YR 및 -RR를 가한 후 Micro-HPLC/IS/ M沒서 확인 • 분석하였다.
- Micro-HPLC/IS/MS를 이용하여 MCST-LR, MCSTYR, MCST-RR를 각각 확인할 수 있는 구조특성을 찾고자, 이들의 혼합 표준용액 (3 mg/L：号 20 由씩 주입하고, 잡혀진 조건에서 TIC 크로마토그램을 얻었다. 또한 정량에 필요한 검량선을 얻고자, 각 표준용액 1, 3, 5 mg/L에 대한 TIC 크로마토그램의 면적을 적분하였다.
- 용리액을 turbovap에서 질소로 건조시키고, 잔류분은 100 의 MeOH에 녹여 시료로 하였다. 망목 0=5 pim의 그물로서 채취한 300~450mL의 조체시료를 고 진공 및 -T8 oC에서 48시간 이상 동결 • 건조시킨 다음, 일정량의 MeOH를 가하여 냉동보관 하였다. 실험할 때는 30 oC 이하의 건조기에서 N虽써 MeOH를 증발시킨 후, 일정량을 취하여 MeOH에 녹이고, 수체시료에서와 같이 고체상 추출법으로 농축시켰다.
- HPLC/Mg용 용매. 예비실험에 의해 확인된 조건 즉, MeOH와 물을 63:37로 혼합하고 trifluoroacetic acid가 0.05% 되게 만든 용매 A와 MeOH에 ammonium acetate 가 5 mM, trifluoroacetic acid가 0.1% 되게 만든 용매 B를 초음파기로 30분 이상 탈기시켜 사용하였다.
대상 데이터
- 시료채취 및 전처리. 98년 7월부터 10월까지 5회(7/14, 8/13, 9/12, 9/22, 10/12冲 걸처 대청호의 대전 취수탑앞, 댐축, 청주 취수탑 앞 및 회남 등 4지점에서 수체와조체시료를 일정량^ 채취하여 다음과 같이 전처리 하였다. 500 mg 수체시료를 GF/C로서 여과한 후, 그여액을 MeOH 10mL와 물 10mL로써 전처리한 Water研｝의 C18카트리지 (Oasisg] 10 mL/min 속도로서 흘려 보내면서 흡착시켰다.
- 1은 이들 microcysti€| 구조를 보여주고 있다. Ammonium acetate(GR, Merck), trifluoroacetic acid (Aldrich), methyl alcohol(99.93%, HPLC grade, Aldrich) 및 acetonitrile(99.8%, HPLC grade, Merck) 등은 그대로 사용하였고, H3PO4, KH2PO4 등은 시약급을, Air 는 zero grad風, 질소가스는 99.99% 이상의 고순도급을 사용하였다.
- HPLC/UV 방법에 사용된 기기는 Perkin-Elmer사의 Series 200/785A 및 Shimadzu사의 LC-10AT/SPD-10A이다 칼럼은 Water#｝의 ^BondapakTM C18(3.9x300mm) 고+ Shimadzu shim-pack CLC-ODS(4.6 mmX250 mm, 5 ^m> 사용하였다. UV 측정에 사용된 파장은 238 nm
- 0 mm, Brownlee columns)이었다. MS에서는 polypropylene 이ycol로 저 질량 5佃I 서부터 고질량 2245까지 최적화하여 사용하였다.
- HPLC/UV용 용매. MeOH와 0.05 M 인산염 완충용액 (pH=3渣' 60:4g로 배합한 용매와 35% Acetonitrile과 0.05 M 인산염 완충용액 (pH=2.5届 혼합한 후 탈기시켜 사용하였다.
- 이며 , 오븐의 온도는 40 oC(LC-10AT), 용리액의 유속은 전자의 기기에서는 2mL/min, 후자의 기기에서는 1 mL/ m面民 유지시켰다. Micro-HPLC/IS/MS 방법에 사용된 기기는 Applied Biosystems사의 HPLC(140C Microgradient system) 및 Perkin-Elmer사의 MS(Sciex API 300)로 구성되었다. 사용한 칼럼은 Perkin-Elmer사의 마이크로 칼럼(Spheri-5, RP-18, 5micron, 250x1.
- Micro-HPLC/IS/MS 방법에 사용된 기기는 Applied Biosystems사의 HPLC(140C Microgradient system) 및 Perkin-Elmer사의 MS(Sciex API 300)로 구성되었다. 사용한 칼럼은 Perkin-Elmer사의 마이크로 칼럼(Spheri-5, RP-18, 5micron, 250x1.0 mm, Brownlee columns)이었다. MS에서는 polypropylene 이ycol로 저 질량 5佃I 서부터 고질량 2245까지 최적화하여 사용하였다.
성능/효과
- 지금까지 발표된 일련의 연구결과에 의하면 MCST-LR, -YR 및 -RR를 확인하는데 특성 스펙트럼인 135 m2와 [M+H+ 즉, MCSTYR는 1045 m/z, MCSTL際 995 m/z, 그리고 MCST-RR는 1038 m/z 만이 측정되어 분석에 이용하여 왔으나, 본 연구에서는 이것 외에 MCST-YR는 1044+18아모늄 이온）의 이중 전하인 532 m/z, -LR는 994+18（암모늄 이온）의 이중전하인 507 m/z 그리고 -RR는 1038의 이중 전하인 520 m/z 를 찾아내었다. Micro-HPLC/IS/MS를 이용한 실험에서 얻은 MCST-LR, MCST-YR 및 MCST-RR 등의표준검량선은 이들의 정량이 가능하도록 직선성을 잘 유지하고 있었다. 기존의 HPLC/UV법은 메트릭스 영향을 받게되므로 이를 최소화할 수 있는 전처리 방법이 선결되어야 했다.
- 3% 이었다. 본 분석값을 참고하면, 댐축 앞 조체시료 중에는 MCST-LR, -YR 및 -RR 등이 함유되지 않았음을 알 수 있다.
- 이러한 현상은 UV에 감지된 메트릭스의 영향으로 생각된다. 이를 확인하기 위하여 MCST-LR, -YR 및 -RR를 각각 10mg/L 씩 취하고, 대전 취수탑 앞에서 채취하여 전처리한 조체시료로서 총 1氓게 희석시켜 만든 합성시료를본 Micro-HPLC/IS/MS 법으로 5회 분석하여 구한 평균값과 상대표준편차를 보면, MCST-LR는 X=10.24ppm, RSD=±5.8称]고, MCSTY^ X=9.99ppm, RSD=±4.0%] 며 또 MCST-RR는 X=9.77ppm, RSD=±5.3% 이었다. 본 분석값을 참고하면, 댐축 앞 조체시료 중에는 MCST-LR, -YR 및 -RR 등이 함유되지 않았음을 알 수 있다.
- Micro-high performance liquid chromatography/ion spray/mass spectrometry（Micro-HPLC/IS/MS^r 이용 하여 microcystin 계열의 MCST-LR, MCST-YR 및 MCSTRR 등의 독성물질을 확인 • 분석하는 일련의 실험을 수행하였다. 지금까지 발표된 일련의 연구결과에 의하면 MCST-LR, -YR 및 -RR를 확인하는데 특성 스펙트럼인 135 m2와 [M+H+ 즉, MCSTYR는 1045 m/z, MCSTL際 995 m/z, 그리고 MCST-RR는 1038 m/z 만이 측정되어 분석에 이용하여 왔으나, 본 연구에서는 이것 외에 MCST-YR는 1044+18아모늄 이온）의 이중 전하인 532 m/z, -LR는 994+18（암모늄 이온）의 이중전하인 507 m/z 그리고 -RR는 1038의 이중 전하인 520 m/z 를 찾아내었다. Micro-HPLC/IS/MS를 이용한 실험에서 얻은 MCST-LR, MCST-YR 및 MCST-RR 등의표준검량선은 이들의 정량이 가능하도록 직선성을 잘 유지하고 있었다.
- 2는 Micro-HPLC/IS/MS로서 얻은 MCST-YR, -LR 및 -RR의 TIC 크로마토그램과 질량 스펙트럼이다. 첫 번째의 TIC 크로마토그램에 의하면, 7:31분에 MCST-YR, 다음에 -LR, 마지막 10:01분에 -RR이 차례대로 나타나고 있음을 확인할 수 있다. 두 번째는 기준 선을 2~3회 공제한 MCST-YR의 질량 스펙트럼이다.
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