국내 주요 상수원지 (영천호, 안계호, 가창호)에서 분리한 6종의 Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis 및 M. wesenbergii)를 대상으로 microcystin 생성유전자(mcy gene) 함유률 및 생성률을 조사하였다. 조사 결과에서 M. aeruginosa는 80%(55개 균주)가 mcy gene을 함유하고 있었으며, 그 다음으로 M. ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내었다. 그 외에 M. flos-aquae와 M. wesenbergii는 각각 11%(4개 균주)와 33% (1개 균주)가 microcystin 생성유전자를 포함하였다. 6종의 Microcystis에서 mcy gene의 함유율은 실제 microcystin 생성율과 거의 일치하였다. 특히, 가장 많은 균주에서 mcy gene이 확인된 M. aeruginosa는 대부분 균주들(75%)이 실제로 microcystin을 생성하는 것으로 조사되었다.
국내 주요 상수원지 (영천호, 안계호, 가창호)에서 분리한 6종의 Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis 및 M. wesenbergii)를 대상으로 microcystin 생성유전자(mcy gene) 함유률 및 생성률을 조사하였다. 조사 결과에서 M. aeruginosa는 80%(55개 균주)가 mcy gene을 함유하고 있었으며, 그 다음으로 M. ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내었다. 그 외에 M. flos-aquae와 M. wesenbergii는 각각 11%(4개 균주)와 33% (1개 균주)가 microcystin 생성유전자를 포함하였다. 6종의 Microcystis에서 mcy gene의 함유율은 실제 microcystin 생성율과 거의 일치하였다. 특히, 가장 많은 균주에서 mcy gene이 확인된 M. aeruginosa는 대부분 균주들(75%)이 실제로 microcystin을 생성하는 것으로 조사되었다.
This study was conducted to investigate whether the presence of mcy gene and microcystin production are related to morphological characteristics of Korean Microcystis species. We isolated 6 different species of Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis and ...
This study was conducted to investigate whether the presence of mcy gene and microcystin production are related to morphological characteristics of Korean Microcystis species. We isolated 6 different species of Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis and M. wesenbergii) from drinking water supply dams (Yeongchun, Ankei, Gachang), and used microscopic method for morphological identification, molecular method for amplifying a partial region of mcyB gene and ELISA method for microcystin analysis. In the present study, 80% of M. aeruginosa strains contained mcy gene, followed by 45% (10 strains) of M. icthyoblabe, 33% (1 strain) of M. wesenbergii, and 11% (4 strains) of M. flos-aquae. Each percentage of mcy gene in Microcystis morphospecies was similar to that of microcystin production in Microcystis morophospecies. In conclusion, the present study shows that molecular method using mcy gene primers can be used as an indirect indicator for the monitoring of toxic cyanobacteria (Microcystis).
This study was conducted to investigate whether the presence of mcy gene and microcystin production are related to morphological characteristics of Korean Microcystis species. We isolated 6 different species of Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis and M. wesenbergii) from drinking water supply dams (Yeongchun, Ankei, Gachang), and used microscopic method for morphological identification, molecular method for amplifying a partial region of mcyB gene and ELISA method for microcystin analysis. In the present study, 80% of M. aeruginosa strains contained mcy gene, followed by 45% (10 strains) of M. icthyoblabe, 33% (1 strain) of M. wesenbergii, and 11% (4 strains) of M. flos-aquae. Each percentage of mcy gene in Microcystis morphospecies was similar to that of microcystin production in Microcystis morophospecies. In conclusion, the present study shows that molecular method using mcy gene primers can be used as an indirect indicator for the monitoring of toxic cyanobacteria (Microcystis).
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문제 정의
본 연구는 국내 주요 상수원 호수에서 분리한 Microcystis 의 형태학적 종들을 대상으로 종들 간 microcystin 생성유전자의 함유율 및 실제 독소 생성비율을 확인하고자 하였으며, 동시에 Microcystis의 형태학적 동정으로 독소생성 가능성을 간접적으로 확인할 수 있는 방법을 제공하고자 하였다.
본 연구에서는 mcy gene primer에 기초한 분자생물학적 방법을 통해 국내 상수원지(댐)에 발생하는 Microcystis의 형태학적 종들 간 mcy gene의 함유율 및 실제 microcystin 생성률의 뚜렷한 차이를 보여주었다. 이는 분자생물학적 방법과 더불어 현미경검경에 기초한 형태학적 종동정만으로 Microcystis와 같은 유해남조류의 독소생성에 대한 간접적인 정보를 제공할 수 있음을 보여준다.
본 연구에서는 mcyB partial gene을 증폭시키는 primers (TOX2P/TOX2F)를 사용하여 Microcystis 종들의 mcy gene 유무를 확인하였다. 이전 연구들에서도 mcyB gene을 지닌 Microcystis 균주들의 높은 microcystin 생성 가능성이 제시된 바 있다(Neilan et al.
제안 방법
Microcystin 분석을 위해 Microcystis 조체를 초음파로 파쇄 후 실린지필터 (Whatmann, 0.2 μm)로 여과하였으며, 제작사의 protocol에 따라 microcystin ELISA Plate Kit (EnviroLogix Inc., USA)를 이용하여 0.16~2.5 ppb의 검출 농도범위에서 microcystin 분석을 실시하였다.
Microcystin 생성유전자 (mcy gene) 검출을 위해 mcyB gene을 target으로 하는 primers (TOX2P/TOX2F)를 사용하여 PCR 실험을 실시하였다(Table 1).
Microcystis 균주들 내 mcy gene의 검출을 위해 PCR을 실시하였다. Microcystis 균주들을 연속적인 희석과정을 거쳐 4,000 g에서 30분간 원심 분리하여 농축시켰다.
PCR 생성물은 PCR purification kit (Bio Basics, Canada) 를 사용하여 정제하였으며, ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 모든 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 검색 프로그램(BLAST 2.
PCR 반응조건은 95℃에서 3분 동안 초기 열처리에 이어 95℃에서 30초, 각 primer쌍의 결합온도에서 30초, 72℃에서 3분을 주기로 하여 30 cycle을 반복하고, 마지막 으로 72℃에서 12분간 처리한 후 반응을 정지시켰다. PCR 생성물의 확인을 위한 전기영동은 1 mM의 EtBr을 포함한 TBE buffer (Promega, USA)에 녹인 1.2% agarose gel상에서 20~30분간 실시하였으며, DNA 밴드는 UV 램프하에서 최종 확인하였다.
국내 주요 상수원지 (영천호, 안계호, 가창호)에서 분리한 6종의 Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis 및 M. wesenbergii)를 대상으로 microcystin 생성유전자(mcy gene) 함유률 및 생성률을 조사하였다.
남조류 동정을 위한 시료 (1 L)는 루골용액 (lugol’s solution)으로 현장에서 즉시 고정하였으며, 실험실로 운반 후 100 mL로 농축한 후에 Sedgwick-Rafter counting chamber를 이용하여 현미경(Zeiss Axioskop 2, Germany) 400~1,000배 하에서 동정 하였다.
aeruginosa의 평균 세포크기에 가까웠다. 따라서, 미동정종으로 분류하였다. 이는 Microcystis 균주들 중 군체의 형태 및 세포의 크기 등에 의해 Microcystis 종들 간의 중간형태가 나타난다고 보고한 Komárek (1991) 의 결과를 잘 반영하였다.
0 Ready Reaction Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 모든 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 검색 프로그램(BLAST 2.1) 을 사용하여 GenBank에 등록된 자료들과 비교함으로써 mcy gene의 일치여부를 확인하였다.
분리된 균 주는 CB 배지(Watanabe, 1996)가 함유된 배양플라스크 (Corning, USA)로 25℃, 약 30 μmol photons m-2s -1 의 연속 광 조건에서 2주간 배양(New Brunswick, Inova, USA) 하였다.
현장에서 채집한 시료를 대상으로 슬라이드 글라스(Meridian, USA) 및 파스퇴르 피펫(Pasteur-type capillary pipette)을 이용하여 Microcystis 균주들을 도립현미경(Olympus JP/CK-2, Japan) 하에서 분리하였다. 분리된 균 주는 CB 배지(Watanabe, 1996)가 함유된 배양플라스크 (Corning, USA)로 25℃, 약 30 μmol photons m-2s -1 의 연속 광 조건에서 2주간 배양(New Brunswick, Inova, USA) 하였다.
대상 데이터
남조류 시료들은 국내 주요 상수원지(영천댐, 안계댐, 가 창댐)에서 플랑크톤 네트(25 μm mesh size) 및 폴리에틸렌병을 이용하여 2 L 원수를 채집하였으며, 채집한 시료들은 아이스박스에 넣어 실험실로 운반하였다.
이론/모형
남조류의 동정은 Komárek (1991)과 Komárek and Anagnostidis(1999)을 참고하여 실시하였다.
성능/효과
wesenbergii는 각각 11% (4개 균주)와 33% (1개 균주)가 microcystin 생성유전자를 포함하였다. 6종의 Microcystis에서 mcy gene의 함유율은 실제 microcystin 생성율과 거의 일치하였다. 특히, 가장 많은 균주에서 mcy gene이 확인된 M.
Komárek and Anagnostidis(1999)가 제안한 형태적 특성 (군체의 형태, 세포 크기, 군체 주위의 젤라틴성 점액질층 등)에 기초하여 실시한 결과, 미동정종 Microcystis 1종을 포함한 134개의 Microcystis 균주들 중 M. aeruginosa가 69 개로 가장 많았으며, M. flos-aquae (36개), M. ichthyoblabe (22개), M. wesenbergii (3개), M. viridis(2개), M. novacekii (1개)를 분리하였다.
Microcystin의 실제 생성을 확인하기 위해 ELISA 분석을 실시한 결과, mcy 유전자를 지니지만 microcystin을 생성하지 않는 균주들을 제외하고 M. aeruginosa 등 대부분 Microcystis 균주들은 microcystin을 생성하여 PCR 결과와 큰 차이가 없었다(Fig. 2). 반면에, 소수의 균주들은 mcy gene은 지니고 있으나, 실제로 microcystin을 생성하지 않았다(Fig.
균주별로 M. aeruginosa는 80%(55개 균주)가 microcystin 생성유전자(mcy gene)를 함유하고 있었으며, 그 다음으로 M. ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내었다. 그 외에 M.
ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내었다. 그 외에 M. flos-aquae와 M. wesenbergii는 각각 11% (4개 균주)와 33% (1개 균주)가 microcystin 생성유전자를 함유하고 있었으며, M. novacekii (1개 균주)에서는 mcy gene 이 확인되지 않았다. M.
, 1998). 또한, 남조류 현존량의 증가는 microcystin 생성에 영향을 주지만, microcystin 농도와 반드시 높은 상관성을 나타내지는 않는다. 이는 모든 남조류가 microcystin 생성유전자를 갖고 있지 않기 때문이며, 환 경조건에 따라 종들 간에도 microcystin 생성 빈도 및 정도 가 다르기 때문이다.
이번 PCR 실험 및 ELISA 분석 결과들에 기초했을 때, 가장 높은 출현빈도를 보인 종들 중 M. aeruginosa 균주들의 대다수(75%)는 microcystin 생성을 하는 것으로 확인된 반면에, M. ichthyoblabe와 M. flos-aquae는 각각 41% (10개 균주)와 8% (4개 균주)의 상대적으로 낮은 microcystin 생성비율을 나타내었다. 이는 M.
이번 연구에서 영천호, 안계호 및 가창호에서 Microcystis 속의 6종(M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis 및 M. wesenbergii)을 분리·동정하였다(Table 2; Fig. 1).
wesenbergii)를 대상으로 microcystin 생성유전자(mcy gene) 함유률 및 생성률을 조사하였다. 조사 결과에서 M. aeruginosa는 80% (55개 균주)가 mcy gene을 함유하고 있었으며, 그 다음으로 M. ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내 었다. 그 외에 M.
6종의 Microcystis에서 mcy gene의 함유율은 실제 microcystin 생성율과 거의 일치하였다. 특히, 가장 많은 균주에서 mcy gene이 확인된 M. aeruginosa는 대부분 균주들(75%)이 실제로 microcystin을 생성하는 것으로 조사되었다.
후속연구
이는 지역적으로 Microcystis 균주들의 microcystin 생성비율의 차이가 존재할 수 있음을 잘 보여준다. 또한 이러한 Microcystis 형태학적 종들 간 microcystin 생성특성(비율) 차이가 주어진 환경요인(수온, 영양염, 광도 등)에 대한 반응성의 차이에서 기인했을 가능성이 있으므로 이에 대한 추가적인 연구가 더 필요하다.
이는 분자생물학적 방법과 더불어 현미경검경에 기초한 형태학적 종동정만으로 Microcystis와 같은 유해남조류의 독소생성에 대한 간접적인 정보를 제공할 수 있음을 보여준다. 반면, 본 연구는 일부 소수의 상수원 댐들을 대상으로 한 결과이므로 향후 수환경 조건이 다른 주요 하천에 적용하기 위해서는 추가적인 관련 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Microcystin이란 무엇인가?
, 1999). Microcystin은 남조류가 생성하는 대표적인 독소이며(Sivonen and Jones, 1999), protein phosphatases type 1과 type2A의 활성을 저해함으로써 간 손상을 유발하는 것으로 보고되었다 (MacKintosh et al., 1990; Runnegar et al.
어류가 microcystin에 노출될 경우 발생하는 문제는 무엇이 있는가?
, 2014). 특히, 어류의 경우 microcystin에 의한 아가미, 소화관, 간 등의 손상이 확인된 바 있다(Pavagadhi et al., 2013).
본 연구에서 Microcystis 균주들을 분리한 후 배양한 방법은 무엇인가?
현장에서 채집한 시료를 대상으로 슬라이드 글라스 (Meridian, USA) 및 파스퇴르 피펫(Pasteur-type capillary pipette)을 이용하여 Microcystis 균주들을 도립현미경 (Olympus JP/CK-2, Japan) 하에서 분리하였다. 분리된 균 주는 CB 배지 (Watanabe, 1996)가 함유된 배양플라스크 (Corning, USA)로 25℃, 약 30 μmol photons m-2 s -1 의 연속 광 조건에서 2주간 배양(New Brunswick, Inova, USA) 하였다.
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