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문제 정의
- 본 연구에서는 어류 근육(생체시료)에 포함되어 있는 상기 3가지 내분비계 장애물질(환경호르몬 물질)의 미량분석을 2가지 내부 표준물질을 이용하여 동시 정량하여, 보다 정확한 분석 결과를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 기체 크로마토그래피-질량분석 기로는 Fisons-8000 기 체 크로마토그래피에 AS 800자동 시료주 입 장치가 부착된 Trio-1000 사 중극자 분석관(quadrupole) 질량분석기(Fisons. Inst., Manchester, UK) 로 구성되어진 것을 사용하였다 GC/MS 분석을 위한 칼럼은 CP SIL 8 CB cross linked 5% phenyl methylsilicone fused-silica capilary column (30m x 0.25mm I.D., 0.25㎛ film thickness)을 사용하였다. 오븐 온도6,23는 처음에 150℃ 에서 분동안 머물게 한 후 1분당 7℃씩 올려 190'C까지 올린 후 1분 동안 머물게 한 후 다시 1분당re씩 올려 250℃ 까지 올린 후 다시 1분당 10℃씩 올려 30 5℃까지 올리고 2분 동안 머물게 하였다.
- 0 mL/MIN로 흘려주었다. 시료 주입구의 온도, 검출기의 온도는 각각 20 0℃, 3(XTC로 맞추었다. 이온화 에너지는 70 eV 가 하여 생성된 이온들은 특정 질량을 가지는 이온만을 선택하여 검출하는 단일이 온 검색 방법 (single ion monitoring, SIM)을 사용하여 분석하였다.
- Octylphenol(OP), nonylphenol(NP), bis(2-ethythexyl) phthalate(BEHP)의 정량은 추출과 정제후 GC/MS-SIM 방식으로 얻어진 l-phenyldecanol(PD)과 bis(2-ethylbutyl) phthalateester(BEBP) 내부 표준물질과의 봉우리 넓이비 를 측정하여 계산하였다. 이때 PD는 OP, NP를 정량하고 BEBP는 BEHP를 정량하였다.
- 3과 같다. Fig. 3에서 머무름 시간 8.8, 7.6~8.4, 10.9, 25.6, 21.3(분)에서 5개의 봉우리가 얻어졌는데 봉우리 1, 2, 3, 4, 5는 각각 octylphenol, nonyljiienol, 1-phenyldecanol, bis(2-ethythexyl) phthalate 와 bis(2-ethylbutyl) phthalate 의 봉우리로 Fig. 2의 GC/MS-TIC 크로마토그램과 각각의 표준용액을 개 별적 으로 주사하여 개별 질량수를 갖는 GC/MS-SIM 크로마토그램을 통해 확인하였다. 시료를 추출 정제후 GC/MS-SIM 방법을 이용하여 실제 어류시료에서 얻은 크로마토그램은 Fig.
대상 데이터
- 시료 주입은 2μL 였고 주입방법은 분할 주입법(split) 을 사용하였으며 분할비는 15:1이었다. 운반기체는 헬륨(99.999%)을 사용했고, 유속은 1.0 mL/MIN로 흘려주었다. 시료 주입구의 온도, 검출기의 온도는 각각 20 0℃, 3(XTC로 맞추었다.
- 모든 용매(diddcmnethane, iso-hexane, methanol, diethyl ether)는 잔류농약분석용(Rathburn, 영국, Walkerbum)을 사용하였고 Ncmylphenol, octylphenol, 1-fiienyldecanol, bis(2vthythexyl)phthalate의 표준용액은 Aldrich 특급 시 약(영국, Gillingham) 을 사용하였다. SPE 칼럼은 International Solute Technology (1ST) (영국, Strathaven) 에서 구입하였다.
- 모든 용매(diddcmnethane, iso-hexane, methanol, diethyl ether)는 잔류농약분석용(Rathburn, 영국, Walkerbum)을 사용하였고 Ncmylphenol, octylphenol, 1-fiienyldecanol, bis(2vthythexyl)phthalate의 표준용액은 Aldrich 특급 시 약(영국, Gillingham) 을 사용하였다. SPE 칼럼은 International Solute Technology (1ST) (영국, Strathaven) 에서 구입하였다. 특히 bis(2Ythylbutyl)phthalateester는 2% 묽은 황산용액에서 phthalic acid와 2*ethylbutanol 을 2시간 동안 반응시켜 합성하여23 불순물을 제거하고 순도 99.
- SPE 칼럼은 International Solute Technology (1ST) (영국, Strathaven) 에서 구입하였다. 특히 bis(2Ythylbutyl)phthalateester는 2% 묽은 황산용액에서 phthalic acid와 2*ethylbutanol 을 2시간 동안 반응시켜 합성하여23 불순물을 제거하고 순도 99.9% 이상으로 유지하여 사용하였다. Silicagel (70~ 230 mesh)은 이염화 메탄으로 세척하여 사용하였고 무수황산나트륨은 Tedia, USA를 사용하였다.
- 9% 이상으로 유지하여 사용하였다. Silicagel (70~ 230 mesh)은 이염화 메탄으로 세척하여 사용하였고 무수황산나트륨은 Tedia, USA를 사용하였다. 또한 모든 유리기구는 메탄올로 세척한 후 다시 이염화 메탄으로 세척하고 건조하여 사용하였다.
- 한국어류시료(Table 3)는 한국해양연구소에서 98년 5월~2000년 8월 사이에 수집하여 분쇄기로 분쇄하고 냉동고에서 얼린 후 동결건조기(FD3, HETO, Denmark) 로 1일간 동결건조한 후 다시 건조기에서 5(TC로 2일간 건조시켜 수분이 없도록 완전히 건조한 후 일정 무게를 유지토록 하고 실온에서 보관하여 사용하였다. 영국시료는 스코트란드 지방의 Frazaborough 지방의 생선 축제에서 2000년 8월 구입하여 분쇄한 후 냉동고에서 얼리고 3일간 동결건조시킨후 다시 KXTC로 건조기에서 건조하여 실온에서 보관하였다.
- 한국어류시료(Table 3)는 한국해양연구소에서 98년 5월~2000년 8월 사이에 수집하여 분쇄기로 분쇄하고 냉동고에서 얼린 후 동결건조기(FD3, HETO, Denmark) 로 1일간 동결건조한 후 다시 건조기에서 5(TC로 2일간 건조시켜 수분이 없도록 완전히 건조한 후 일정 무게를 유지토록 하고 실온에서 보관하여 사용하였다. 영국시료는 스코트란드 지방의 Frazaborough 지방의 생선 축제에서 2000년 8월 구입하여 분쇄한 후 냉동고에서 얼리고 3일간 동결건조시킨후 다시 KXTC로 건조기에서 건조하여 실온에서 보관하였다.
- OP, NP 감응지수는 3 mg/L의 octylphenol, nonylphen이과 3mg/L의 PD 표준용액의 면적비로, BEHP는 35㎎/L의 BEHP와 BEBP의 면적 비로 계산하였다(Table 2), 일반적으로 내부 표준물질로는 동위원소로 치환된 fluoranthene-dio, phenanthrene-dio, pyrene-dn등이 사용되며 보다 더 정확한 정량을 위해서는 동위원소로 치환된 정량화합물질이 사용되나 이들 동위원소치환화합물은 매우 고가이며 구입하기가 매우 어렵다. 본 연구에서는 OP, NP는 구조적으로 매우 유사한 l-phenyldecanol(Fig 1 참조)을 사용하였고, bis(2~ethythexyl)phthalate는 물리 화학적 성질이 매우 비슷한 bis-2(ethylbutyl)phthalate를 내부 표준물질로 사용하였다. 다중점 회수율 실험은 기지의 실험용 어류시료 0.
이론/모형
- 시료 주입구의 온도, 검출기의 온도는 각각 20 0℃, 3(XTC로 맞추었다. 이온화 에너지는 70 eV 가 하여 생성된 이온들은 특정 질량을 가지는 이온만을 선택하여 검출하는 단일이 온 검색 방법 (single ion monitoring, SIM)을 사용하여 분석하였다. SIM 방법에서 사용된 이온들은 각 화합물의 특정 질량중 서로 겹치지 않는 것을 선택하였고 이때 확인용이온과 정량용이온을 구별하여 사용하였다.
- 이것을 GC/MS vial에 옮겨질 소기체하에서 완전히 건조시킨다. 여기에 70㎕ diethyl ether를 가하여 다시 용해시킨 후 GC/MS-SIM 방법으로 분석한다. 이 생체시료에 대한 검출 한계를 Table 4에 나타냈다.
- 특히 본 연구에서 연구하고자 하는 생체시료(쇠고기, 돼지고기, 양서류, 어류)는 수분, 지방산, triglyceride, cholesterol, cholesterylester 등의 지방 성분을 포함하고 있기 때문에 특정 EDC 물질만을 검출하기 위해서는 완벽한 추출 분리 농축 과정을 거쳐 방해물질을 제거한 후 그들의 간섭을 최소화시켜야한다. Tsuda22등은 극성이 강한 Florisil 칼럼과 hexane을 이용하여 방해물질을 분리제거하였으며, 본 연구에서도 극성이 강한 aminopropyl 칼럼을 이용하여 흡착시킨 후 방해물질인 지방산, triglyceride, cholesterol, cholesterylester 등은 iso-hexane 으로 제거하였다 저 불순물을 분리제거한 후 정확한 정량을 위하여 각각의 분석물질의 특성과 유사한 2가지 내부 표준물질을 사용하였고, 이들 물질 중 서로 겹치지 않는 질량을 갖는 조각이온을 선택하여 연속적으로 검색하는 단일이 온 검색법 (single ion monitoring, SIM)을 사용하였다. 다중점 보정을 위한 회수율은 Table 5에 나타냈다.
- 시료 주입은 2μL 였고 주입방법은 분할 주입법(split) 을 사용하였으며 분할비는 15:1이었다. 운반기체는 헬륨(99.
성능/효과
- 64였다. PD를 내부표준물질로 한 OP, NP 내분비계 장애물 질에 대한 감응지수는 각각 0.1158, 0.1989이며 BEBP를 내부 표준물질로 한 BEHP의 감응지수는 0.1821로 1보다 작은 값을 나타냈으며, 이것은 각각의 물질에 대한 독특한 기기적 감응반응 특성으로 해석된다. 농도를 알고 있는 어류시료로부터 PD 내부표준물 질에 의한 OP, NP 물질의 회수율과 BEBP 내부표준물질을 기준으로 한 BEHP의 회수율을 Table 5에 나타냈다.
- 06㎍/g이었다. BEHP의 경우는 3점의 시료를 제외한 거의 모든 시료에서 검출되었는데 최소 0.28㎍/g에서 최대 2.99㎍/g로 평균적으로 NP의 10~20배 이상 검출되었다. 특히 영국어류 시료 12, 13, 14중 12번 시료에서 BEHP가 최고 2.
- 결론적으로 OP, NP, BEHP의 동시 정량을 2가지 내 부표준 물질인 P*} I bis(2Ythylbutyl)phthalate을 이용하면 한 가지 내부 표준물질 [bis(2-ethylbutyl)phthalate] 을 이용하는 방법보다 더 좋은 회수율을" 나타내어 보다 정확한 정량을 가능케 하였다.
- 1.한국과 영국어류 시료에 포함된 octyljAaiol, nonylphenol, bis(2Ythythexyl)phthalMe를 2가지 내부표준 물질 을 이용하여 GC/MS-SIM 방법으로 30분 안에 정량하였으며 PD를 내부표준물질로 한 다중점 회수율 측정 결과 OP는 0.2~20㎍에서 75% 이상의 회수율을 나타냈고, NP는 같은 농도 범위에서 81% 이상의 회수율을 나타냈다. BEHP는 0.
- 2~20㎍에서 75% 이상의 회수율을 나타냈고, NP는 같은 농도 범위에서 81% 이상의 회수율을 나타냈다. BEHP는 0.4~40㎍/g의 넓은 농도 범위에서 평균 108%의 매우 좋은 회수율을 보였다.
- 2.이 방법을 한국과 영국의 어류시료에 적용시킨 결과 내분비계 장애물질로 주목되는 nonylphenole 극히 적은 양의 시료에서 검출되었으며, bis(2-ethythexyl) phthalate는 0.18㎍g ~2.99㎍/g이 포함되어 있었고 한국 어류시료가 영국 것에 비해 다수의 시료에서 BEHP가 검출되었다.
- 3.분석결과 NP와 BEHP의 농도 범위는 10배 이상 차이가 나므로 이를 위한 동시정량에서도 각각 10배 이상의 차이가 나는 농도에서 회수율, 감응지수 등을 구하여 적용해야 보다 정확한 결과를 얻을 것으로 사료된다.
- 4.이 방법에서는 한국과 영국어류 시료에서 octyl- phenole 전혀 검출되지 않았다.
후속연구
- W7M23-27 환경시료에서는 EDC 물질이수 ng /L(parts per billion) 또는 ng/L(parts per trillion)로 존재하므로 이들을 검출하기 위하여 추출 분리 농축 과정을 거쳐야 한다. 특히 본 연구에서 연구하고자 하는 생체시료(쇠고기, 돼지고기, 양서류, 어류)는 수분, 지방산, triglyceride, cholesterol, cholesterylester 등의 지방 성분을 포함하고 있기 때문에 특정 EDC 물질만을 검출하기 위해서는 완벽한 추출 분리 농축 과정을 거쳐 방해물질을 제거한 후 그들의 간섭을 최소화시켜야한다. Tsuda22등은 극성이 강한 Florisil 칼럼과 hexane을 이용하여 방해물질을 분리제거하였으며, 본 연구에서도 극성이 강한 aminopropyl 칼럼을 이용하여 흡착시킨 후 방해물질인 지방산, triglyceride, cholesterol, cholesterylester 등은 iso-hexane 으로 제거하였다 저 불순물을 분리제거한 후 정확한 정량을 위하여 각각의 분석물질의 특성과 유사한 2가지 내부 표준물질을 사용하였고, 이들 물질 중 서로 겹치지 않는 질량을 갖는 조각이온을 선택하여 연속적으로 검색하는 단일이 온 검색법 (single ion monitoring, SIM)을 사용하였다.
- 5.본 연구결과에 의하면 국내에 유통되는 어류시료에는 적은 양의 NP와 많은 어류가 BEHP를 포함하고 있음을 시사하는 것이라 사료되어 이에 대한 보다 광범위한 조사연구와 위해성평가연구 등이 절실히 요망된다.
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