[국내논문]군소 (Aplysia kurodai)의 중추신경계로부터 myomodulin A와 E의 정제 Purification of Myomodulin A and Myomodulin E from the Central Nervous System of the Sea Hare, Aplysia kurodai원문보기
군소의 중추신경계로부터 myomodulin A (MMA)과 myomodlin E (MME)의 정제에 대해 보고하고자 한다. 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column system에 적용하여 두가지 신경성 펩타이드를 정제하였다. HPLC 분리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edulis)의 ABRM을 이용하였다. 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다. 정제한 MMA와 MME의 일차구조는 각각 Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (847.41 Da) 과 Gly-Leu-Gln-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (830.50Da) 이었다. 또한 이들 합성 펩타이드는 진주담치의 ABRM에 대해 phasic contration의 조절활성을 나타내었다.
군소의 중추신경계로부터 myomodulin A (MMA)과 myomodlin E (MME)의 정제에 대해 보고하고자 한다. 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column system에 적용하여 두가지 신경성 펩타이드를 정제하였다. HPLC 분리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edulis)의 ABRM을 이용하였다. 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다. 정제한 MMA와 MME의 일차구조는 각각 Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (847.41 Da) 과 Gly-Leu-Gln-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (830.50Da) 이었다. 또한 이들 합성 펩타이드는 진주담치의 ABRM에 대해 phasic contration의 조절활성을 나타내었다.
This paper reports the purification of myomodulin A (MMA) and myomodulin E (MME) from the sea hare. The central nervous systems of 500 sea hare were extracted in an acidified solvent, after which four HPLC column systems were used to obtain pure peptides, The phasic contraction bioassay using a Myti...
This paper reports the purification of myomodulin A (MMA) and myomodulin E (MME) from the sea hare. The central nervous systems of 500 sea hare were extracted in an acidified solvent, after which four HPLC column systems were used to obtain pure peptides, The phasic contraction bioassay using a Mytilus edulis anterior byssus retractor muscle (ABRW) was applied to monitor all collected fractions. The pure peptides were submitted to Edman degradation based automated microsequencing. Mass spectrometry and chemical synthesis confirmed the sequence. The primary structures of MMA and MME were Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (847.41 Da) and Cly-Leu-Gln-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (830.50 Da), respectively. Synthetic peptides showed a modulating activity of phasic contraction in the ABRM of Mrtilus edulis.
This paper reports the purification of myomodulin A (MMA) and myomodulin E (MME) from the sea hare. The central nervous systems of 500 sea hare were extracted in an acidified solvent, after which four HPLC column systems were used to obtain pure peptides, The phasic contraction bioassay using a Mytilus edulis anterior byssus retractor muscle (ABRW) was applied to monitor all collected fractions. The pure peptides were submitted to Edman degradation based automated microsequencing. Mass spectrometry and chemical synthesis confirmed the sequence. The primary structures of MMA and MME were Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (847.41 Da) and Cly-Leu-Gln-Met-Leu-Arg-Leu-$NH_2$, (830.50 Da), respectively. Synthetic peptides showed a modulating activity of phasic contraction in the ABRM of Mrtilus edulis.
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문제 정의
군소의 중추신경계로부터 myomodulin A(MMA)과 myomod- lin E (MME)의 정제에 대해 보고하고자 한다. 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column sys- tem에 적용하여 두 가지 신경성 펩타이드를 정제하였다.
그러나 우리나라 연근해에서 식하는 군소 (Aplysia kurodai)는 식용이외에는 거의 이용이 없는 실정이며, 군소의 중추신경계를 이용한 신경성 펩타이드에 관한 연구는 지금까지 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 군소 의 중주신경절에서 진주담치 ABRM의 phasic contraction을 조절 하는 2종류의 myomodulin-related peptide를 정제하였기에 그들의 활성과 함께 보고하고자 한다.
제안 방법
군소의 중추신경계로부터 myomodulin A(MMA)과 myomod- lin E (MME)의 정제에 대해 보고하고자 한다. 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column sys- tem에 적용하여 두 가지 신경성 펩타이드를 정제하였다. HPLC 분 리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edu/is)의 ABRM을 이용하였다.
500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column sys- tem에 적용하여 두 가지 신경성 펩타이드를 정제하였다. HPLC 분 리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edu/is)의 ABRM을 이용하였다. 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미 노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다.
) 를 이용하여 측정하였다. Protein sequencer (Shimadzu PSQ-1 protein sequencer, Japan)를 사용하여 아미노산 서열을 분석하였다.
편의상 각각의 용출액을 RM10과 RM60 으로 나타내었다. RM10과 RM60의 1/500에 해당하는 양을 사용하여 활성을 측정한 후, 진주담치의 ABRM의 phasic contraction 에 대하여 억제활성을 나타낸 RM60 용출액 (Fig. 1)에서 생리활 성 물질을 정제하였다.
진주담치의 ABRM에 대해 활성을 나타낸 RM60을 사용하여 4 단계에 걸쳐 HPLC로 분리하였다. 각각의 분리단계에서 얻은 분 획들은 ABRM을 사용하여 생리활성을 측정하였다.
군소의 신경절 추출물인 RM60으로부터 진주담치 ABRM의 phasic contraction에 대한 조절 활성을 가지는 peptide를 분리하기 위해서 역상 column과 양이온 교환 column을 반복적으로 사용하였다.
신경성 펩타이드의 추출을 위한 재료는 군소의 중추신경계를 해부현미경하에서 절취하여 액체질소로 급속 동결시킨 후, -8(化 에 냉동 보관하여 재료로 사용하였다. 그리고 근육의 phasic con- traction에 대한 조절활성을 측정하기 위해 진주담치 (的㎛$ edi边s)의 ABRM을 사용하였다.
그리고, 합성물과 천연물의 동일성을 비교하기 위하여 Spheri- sorb ODS2 column을 사용하여 펩타이드들의 retention time을 즉정하였다. Fig.
이러한 결과로부터 합성 MMA와 MME는 모두 천연 peptide와 동일 물질인 것으로 판명되었다. 따라서 합성 펩타이드를 사용하여 ABRM의 phasic contraction에 대한 조절활성을 농도 의존적 으로 조사하였다. MMA는 저농도 (1(厂'°~1(厂51)에서 phasic contraction의 수죽을 증가시켰으나, 고농도 (iOeM)에서는 phasic contraction을 억제하였다.
추출한 용액을 에서 20분 동안 8, 000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 취한 후 농축하여 동결 건조 하였다. 이 분말을 5mL의 0.1% TFA 수용액 (pH 2.2)에 녹인 후 Sep-pak C18 cartridge를 사용하여 각각 ]0% 와 60% CH3CN으 로 용출하여 분리하였다. 편의상 각각의 용출액을 RM10과 RM60 으로 나타내었다.
(Muneoka and Kamura, 1982; Muneoka and Saito, 1986). 이러한 여러 물질들에 대해 반응이 뛰어난 ABRM을 이용하여 군소의 중추신경계로부터 부분 정제한 RM10과 RM60의 phasic contraction 활성을 측정하였다. RM60은 진주담치 ABRM 의 control phasic contraction에 대해 약 87.
준비한 ABRM의 아래쪽 부분을 반응조의 지지대에 고정시키고 윗부분을 transducer에 연결하여 5g의 장력을 걸었으며, 반복적인 전기자극(23V, 3msec, 50Hz)을 하여 각 분획에 대해 활성여부 를 측정하였다. Phasic contractione 10분 간격으로 행하였으며, 각 시료 용액은 phasic contraction의 8분 전에 적용하였다.
진주담치의 ABRM에 대해 활성을 나타낸 RM60을 사용하여 4 단계에 걸쳐 HPLC로 분리하였다. 각각의 분리단계에서 얻은 분 획들은 ABRM을 사용하여 생리활성을 측정하였다.
진주담치의 좌우 패각을 열고, 면실을 이용하여 ABRM을 길이 가 약 1cm가 되도록 윗부분과 아랫부분을 묶은 다음 적출하였다. 적출한 ABRMe 인공해수로 채워진 2mL의 chamber에 고정시 켰다.
대상 데이터
44 firn) 와 Sep-Pak Vac C” car- tridge는 Waters사 (Waters associates, Miliford, MA, USA)에서, 정제에 사용한 Sephadex G-25는 Pharmacia (LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)사에서 구입하였다. 또한 HPLC-grade용 water와 acetonitrilee TEDIA (Ohio, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
시료의 여과를 위해 사용한 Millex-LCR13(0.5四i), Ultrafree- MC(0.45 /Jtn) 및 syringe filter(0.44 firn) 와 Sep-Pak Vac C” car- tridge는 Waters사 (Waters associates, Miliford, MA, USA)에서, 정제에 사용한 Sephadex G-25는 Pharmacia (LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)사에서 구입하였다. 또한 HPLC-grade용 water와 acetonitrilee TEDIA (Ohio, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
신경성 펩타이드의 추출을 위한 재료는 군소의 중추신경계를 해부현미경하에서 절취하여 액체질소로 급속 동결시킨 후, -8(化 에 냉동 보관하여 재료로 사용하였다. 그리고 근육의 phasic con- traction에 대한 조절활성을 측정하기 위해 진주담치 (的㎛$ edi边s)의 ABRM을 사용하였다.
최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미 노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다. 정제한 MMA와 MME의 일차구조는 각각 Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-NHi(847.41 Da)과 Gly-Leu-Gln- Met-Leu-Arg-Leu-NHz (830.50Da) 이었다. 또한 이들 합성 펩타 이드는 진주담치의 ABRM에 대해 phasic contration의 조절활성을 나타내었다.
이론/모형
군소의 중추신경계로부터 정제한 2개의 peak에 대한 아미노산 의 서열과 분자량을 알아보기 위하여 질량분석기와 Edman 분해 법을 이용한 아미노산 서열 분석기를 사용하였다.
이전에 보고된 Fmoc-법을 사용하여 고상법으로 펩타이드를 합성 하였고 (Park et al., 1997), HPLC를 이용하여 최종 정제하였다.
정제한 MMA와 MME는 고상합성법으로 합성하였다. 합성한 펩 타이드와 천연 펩타이드와의 동일성을 확인하기 위해서 MALDI- TOF-Mass와 역상 및 양이온 교환 HPLC를 이용하여 비교하였다, 합성한 펩타이드를 MALD「TOF-Mass로 측정한 결과, 두 물질의 이론치와 측정치는 서로 잘 일치하였다: myomodulin A, CaMQNn S2 846.
펩타이드들의 분자량 측정은 MALDI-TOF-MASS Spectrometer (Voyager-DE™ PRO, Perseptive Biosystems사, U.SA.) 를 이용하여 측정하였다. Protein sequencer (Shimadzu PSQ-1 protein sequencer, Japan)를 사용하여 아미노산 서열을 분석하였다.
성능/효과
4C). MME 또한 MMA와 동일한 방법과 조건을 사용하여 천연물 과 합성물의 동일성을 확인하였으며 동일한 시간대의 retention time (13 min)을 가졌다 (data not shown).
6X300mm) column을 이용하여 분리하였다. 각 ImL씩 분취한 분획의 1/250 (v/v)을 이용하여 ABRM에 대한 phasic contraction의 조절활성을 측정한 결과, 두 분획에서 ABRM의 control phasic contraction에 대하여 60% 정도의 저해작용이 나타났다. Phasic contraction을 저해하는 두 분 획을 각각 10mM phosphate buffer (pH 6.
따라서 peak A를 myomodulin A (MMA), peak B를 myomodulin E(MME)로 명명하였다. 또한, 이러한 연구 결과는 MMA와 MME가 &浙血의 종에 상관없이 폭넓게 존재할 수 있음을 시사한다.
2(A)는 ODS*80im column을 사용하여 활성 분획의 세 번째 분리 단계를 나타낸다. 분리한 분획을 사용하여 활성을 측정한 결과 retention time 38분에서 용출된 peak가 ABRM의 control phasic contraction에 대하여 44.4% 수축을 저해하였다 (Fig. 2(B)).
7)으로 평형화되어 있는 양이온 교환 SP-5PW column을 사용하여 분리하였다. 이들 분획을 양이온 교환 column으로 분리한 후, 각각의 분획을 1/200 (v/v) 취 하여 측정한 결과 retention time 23분의 peak에서 control phasic contraction의 20% 저해 활성을 나타내었다 (data not shown). Fig.
이러한 결과로부터 합성 MMA와 MME는 모두 천연 peptide와 동일 물질인 것으로 판명되었다. 따라서 합성 펩타이드를 사용하여 ABRM의 phasic contraction에 대한 조절활성을 농도 의존적 으로 조사하였다.
HPLC 분 리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edu/is)의 ABRM을 이용하였다. 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미 노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다. 정제한 MMA와 MME의 일차구조는 각각 Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-NHi(847.
한편, 진주담치의 ABRM, 발 신경절 (pedal ganglia) 및 A fu- lica의 신경절로부터 약 30종류의 Mytilus inhibitory peptide (MIP) 관련 펩타이드가 정제되었으며, 이들은 약 6~15개의 아미 노산 잔기로 구성되어 있다. (Hirata et al.
정제한 MMA와 MME는 고상합성법으로 합성하였다. 합성한 펩 타이드와 천연 펩타이드와의 동일성을 확인하기 위해서 MALDI- TOF-Mass와 역상 및 양이온 교환 HPLC를 이용하여 비교하였다, 합성한 펩타이드를 MALD「TOF-Mass로 측정한 결과, 두 물질의 이론치와 측정치는 서로 잘 일치하였다: myomodulin A, CaMQNn S2 846.04, (M + H) 847.41; myomodulin E, C36H68O8N12S 829.00, (M + H) + 830.50.
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