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문제 정의
- 군소의 중추신경계로부터 myomodulin A(MMA)과 myomod- lin E (MME)의 정제에 대해 보고하고자 한다. 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column sys- tem에 적용하여 두 가지 신경성 펩타이드를 정제하였다.
- 그러나 우리나라 연근해에서 식하는 군소 (Aplysia kurodai)는 식용이외에는 거의 이용이 없는 실정이며, 군소의 중추신경계를 이용한 신경성 펩타이드에 관한 연구는 지금까지 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 군소 의 중주신경절에서 진주담치 ABRM의 phasic contraction을 조절 하는 2종류의 myomodulin-related peptide를 정제하였기에 그들의 활성과 함께 보고하고자 한다.
제안 방법
- 군소의 중추신경계로부터 myomodulin A(MMA)과 myomod- lin E (MME)의 정제에 대해 보고하고자 한다. 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column sys- tem에 적용하여 두 가지 신경성 펩타이드를 정제하였다. HPLC 분 리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edu/is)의 ABRM을 이용하였다.
- 500마리 군소의 중추신경계를 산조건으로 추출한 후 4종류의 HPLC column sys- tem에 적용하여 두 가지 신경성 펩타이드를 정제하였다. HPLC 분 리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edu/is)의 ABRM을 이용하였다. 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미 노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다.
- ) 를 이용하여 측정하였다. Protein sequencer (Shimadzu PSQ-1 protein sequencer, Japan)를 사용하여 아미노산 서열을 분석하였다.
- 편의상 각각의 용출액을 RM10과 RM60 으로 나타내었다. RM10과 RM60의 1/500에 해당하는 양을 사용하여 활성을 측정한 후, 진주담치의 ABRM의 phasic contraction 에 대하여 억제활성을 나타낸 RM60 용출액 (Fig. 1)에서 생리활 성 물질을 정제하였다.
- 진주담치의 ABRM에 대해 활성을 나타낸 RM60을 사용하여 4 단계에 걸쳐 HPLC로 분리하였다. 각각의 분리단계에서 얻은 분 획들은 ABRM을 사용하여 생리활성을 측정하였다.
- 군소의 신경절 추출물인 RM60으로부터 진주담치 ABRM의 phasic contraction에 대한 조절 활성을 가지는 peptide를 분리하기 위해서 역상 column과 양이온 교환 column을 반복적으로 사용하였다.
- 신경성 펩타이드의 추출을 위한 재료는 군소의 중추신경계를 해부현미경하에서 절취하여 액체질소로 급속 동결시킨 후, -8(化 에 냉동 보관하여 재료로 사용하였다. 그리고 근육의 phasic con- traction에 대한 조절활성을 측정하기 위해 진주담치 (的㎛$ edi边s)의 ABRM을 사용하였다.
- 그리고, 합성물과 천연물의 동일성을 비교하기 위하여 Spheri- sorb ODS2 column을 사용하여 펩타이드들의 retention time을 즉정하였다. Fig.
- 이러한 결과로부터 합성 MMA와 MME는 모두 천연 peptide와 동일 물질인 것으로 판명되었다. 따라서 합성 펩타이드를 사용하여 ABRM의 phasic contraction에 대한 조절활성을 농도 의존적 으로 조사하였다. MMA는 저농도 (1(厂'°~1(厂51)에서 phasic contraction의 수죽을 증가시켰으나, 고농도 (iOeM)에서는 phasic contraction을 억제하였다.
- 추출한 용액을 에서 20분 동안 8, 000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 취한 후 농축하여 동결 건조 하였다. 이 분말을 5mL의 0.1% TFA 수용액 (pH 2.2)에 녹인 후 Sep-pak C18 cartridge를 사용하여 각각 ]0% 와 60% CH3CN으 로 용출하여 분리하였다. 편의상 각각의 용출액을 RM10과 RM60 으로 나타내었다.
- (Muneoka and Kamura, 1982; Muneoka and Saito, 1986). 이러한 여러 물질들에 대해 반응이 뛰어난 ABRM을 이용하여 군소의 중추신경계로부터 부분 정제한 RM10과 RM60의 phasic contraction 활성을 측정하였다. RM60은 진주담치 ABRM 의 control phasic contraction에 대해 약 87.
- 준비한 ABRM의 아래쪽 부분을 반응조의 지지대에 고정시키고 윗부분을 transducer에 연결하여 5g의 장력을 걸었으며, 반복적인 전기자극(23V, 3msec, 50Hz)을 하여 각 분획에 대해 활성여부 를 측정하였다. Phasic contractione 10분 간격으로 행하였으며, 각 시료 용액은 phasic contraction의 8분 전에 적용하였다.
- 진주담치의 ABRM에 대해 활성을 나타낸 RM60을 사용하여 4 단계에 걸쳐 HPLC로 분리하였다. 각각의 분리단계에서 얻은 분 획들은 ABRM을 사용하여 생리활성을 측정하였다.
- 진주담치의 좌우 패각을 열고, 면실을 이용하여 ABRM을 길이 가 약 1cm가 되도록 윗부분과 아랫부분을 묶은 다음 적출하였다. 적출한 ABRMe 인공해수로 채워진 2mL의 chamber에 고정시 켰다.
대상 데이터
- 44 firn) 와 Sep-Pak Vac C” car- tridge는 Waters사 (Waters associates, Miliford, MA, USA)에서, 정제에 사용한 Sephadex G-25는 Pharmacia (LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)사에서 구입하였다. 또한 HPLC-grade용 water와 acetonitrilee TEDIA (Ohio, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 시료의 여과를 위해 사용한 Millex-LCR13(0.5四i), Ultrafree- MC(0.45 /Jtn) 및 syringe filter(0.44 firn) 와 Sep-Pak Vac C” car- tridge는 Waters사 (Waters associates, Miliford, MA, USA)에서, 정제에 사용한 Sephadex G-25는 Pharmacia (LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)사에서 구입하였다. 또한 HPLC-grade용 water와 acetonitrilee TEDIA (Ohio, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 신경성 펩타이드의 추출을 위한 재료는 군소의 중추신경계를 해부현미경하에서 절취하여 액체질소로 급속 동결시킨 후, -8(化 에 냉동 보관하여 재료로 사용하였다. 그리고 근육의 phasic con- traction에 대한 조절활성을 측정하기 위해 진주담치 (的㎛$ edi边s)의 ABRM을 사용하였다.
- 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미 노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다. 정제한 MMA와 MME의 일차구조는 각각 Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-NHi(847.41 Da)과 Gly-Leu-Gln- Met-Leu-Arg-Leu-NHz (830.50Da) 이었다. 또한 이들 합성 펩타 이드는 진주담치의 ABRM에 대해 phasic contration의 조절활성을 나타내었다.
이론/모형
- 군소의 중추신경계로부터 정제한 2개의 peak에 대한 아미노산 의 서열과 분자량을 알아보기 위하여 질량분석기와 Edman 분해 법을 이용한 아미노산 서열 분석기를 사용하였다.
- 이전에 보고된 Fmoc-법을 사용하여 고상법으로 펩타이드를 합성 하였고 (Park et al., 1997), HPLC를 이용하여 최종 정제하였다.
- 정제한 MMA와 MME는 고상합성법으로 합성하였다. 합성한 펩 타이드와 천연 펩타이드와의 동일성을 확인하기 위해서 MALDI- TOF-Mass와 역상 및 양이온 교환 HPLC를 이용하여 비교하였다, 합성한 펩타이드를 MALD「TOF-Mass로 측정한 결과, 두 물질의 이론치와 측정치는 서로 잘 일치하였다: myomodulin A, CaMQNn S2 846.
- 펩타이드들의 분자량 측정은 MALDI-TOF-MASS Spectrometer (Voyager-DE™ PRO, Perseptive Biosystems사, U.SA.) 를 이용하여 측정하였다. Protein sequencer (Shimadzu PSQ-1 protein sequencer, Japan)를 사용하여 아미노산 서열을 분석하였다.
성능/효과
- 4C). MME 또한 MMA와 동일한 방법과 조건을 사용하여 천연물 과 합성물의 동일성을 확인하였으며 동일한 시간대의 retention time (13 min)을 가졌다 (data not shown).
- 6X300mm) column을 이용하여 분리하였다. 각 ImL씩 분취한 분획의 1/250 (v/v)을 이용하여 ABRM에 대한 phasic contraction의 조절활성을 측정한 결과, 두 분획에서 ABRM의 control phasic contraction에 대하여 60% 정도의 저해작용이 나타났다. Phasic contraction을 저해하는 두 분 획을 각각 10mM phosphate buffer (pH 6.
- 따라서 peak A를 myomodulin A (MMA), peak B를 myomodulin E(MME)로 명명하였다. 또한, 이러한 연구 결과는 MMA와 MME가 &浙血의 종에 상관없이 폭넓게 존재할 수 있음을 시사한다.
- 2(A)는 ODS*80im column을 사용하여 활성 분획의 세 번째 분리 단계를 나타낸다. 분리한 분획을 사용하여 활성을 측정한 결과 retention time 38분에서 용출된 peak가 ABRM의 control phasic contraction에 대하여 44.4% 수축을 저해하였다 (Fig. 2(B)).
- 7)으로 평형화되어 있는 양이온 교환 SP-5PW column을 사용하여 분리하였다. 이들 분획을 양이온 교환 column으로 분리한 후, 각각의 분획을 1/200 (v/v) 취 하여 측정한 결과 retention time 23분의 peak에서 control phasic contraction의 20% 저해 활성을 나타내었다 (data not shown). Fig.
- 이러한 결과로부터 합성 MMA와 MME는 모두 천연 peptide와 동일 물질인 것으로 판명되었다. 따라서 합성 펩타이드를 사용하여 ABRM의 phasic contraction에 대한 조절활성을 농도 의존적 으로 조사하였다.
- HPLC 분 리과정에서 얻어진 모든 분획의 활성을 조사하기 위하여 bioassay system으로 진주담치 (Mytilis edu/is)의 ABRM을 이용하였다. 최종 정제된 신경성 펩타이드는 Edman 분해법을 이용한 아미 노산 서열 분석기, 질량분석기와 화학합성을 통해 완전한 일차구조를 밝힐 수 있었다. 정제한 MMA와 MME의 일차구조는 각각 Pro-Met-Ser-Met-Leu-Arg-Leu-NHi(847.
- 한편, 진주담치의 ABRM, 발 신경절 (pedal ganglia) 및 A fu- lica의 신경절로부터 약 30종류의 Mytilus inhibitory peptide (MIP) 관련 펩타이드가 정제되었으며, 이들은 약 6~15개의 아미 노산 잔기로 구성되어 있다. (Hirata et al.
- 정제한 MMA와 MME는 고상합성법으로 합성하였다. 합성한 펩 타이드와 천연 펩타이드와의 동일성을 확인하기 위해서 MALDI- TOF-Mass와 역상 및 양이온 교환 HPLC를 이용하여 비교하였다, 합성한 펩타이드를 MALD「TOF-Mass로 측정한 결과, 두 물질의 이론치와 측정치는 서로 잘 일치하였다: myomodulin A, CaMQNn S2 846.04, (M + H) 847.41; myomodulin E, C36H68O8N12S 829.00, (M + H) + 830.50.
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