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문제 정의
- 의 잎날개에 오배자 진드기 Melaphis chinensi(BELL)가 기생하여 만들어진 충영으로 염폐, 삽장, 해독작용과 더불어 지혈작용이 있어 각종 출혈 등에 응용되고 있으며,13)현재까지는 항균작용에 대한 실험 보고만 있을 뿐 항혈전작용에 대한 연구는 보고된 바 없다.14) 이에 저자는 오배자가 각종 출혈증에 응용된다는 점에 착안하여, 이를 시료로 in vivo에서 collagen과 ADP를 이용하여 혈소판 응집 억제효과를 탐색하고, in vivo에서 endotoxin과 hydrocortisone acetate(HA)으로 유도된 병태 모델을 이용하여 혈소판수와 coagulation parameter인 prothrombin time(PT), activated partial thromboplastin time(APTT) 및fibrinogen 양의 측정을 통하여 항혈전작용을 탐색하였던 바 유의성 있는 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- , Ltd)를 사용하여 Bom등15)의 방법에 따라 탁도측정법으로 실시하였다. Cuvette에 PRP 400μl, collagen(50 μg/mZ) 50μl 또는 ADP (20μM/ml) 50 B, GR 50 W를 조심스럽게 넣고 혈소판 응집도를 관찰하였다.
- HA의 첫 근육주사 24시간 경과 후 7일간 정상군과 대조군은 멸균생리식염수를, GR 투여군은 20 mg/kg 농도로 zondef- 이용하여 경구투여하였으며, 양성대조군인 urokinase군은 2, 500 U/kg의 농도로 근육 주사하여 HA 유발 8일째에 채혈을 실시하였다. HA 및 약물을 최종 투여한 24시간 후 백서를 ether로 가볍게 마취시키고 심장 천자로 6ml의 혈액을 3.8% sodium citrate 0.6 mZ가 들어 있는 1회용 주사기로 채취하여 1.5 m2는 다른 시험관에 넣어 platelet 수치 검사 혈액으로 사용하였고 나머지는 centrifuge tube에 넣고 바로 원심분리기에서 3,000 r.p.m으로 15분간 원심분리시켜 상층의 혈청을 serum separator에 취하여 fibrinogen양 및 PT, APTT 측정에 사용하였다.
- 15 ml/300 g)를, 대조군과 GR 투여군 및 urokinase군은 HA(5 mg/kg)를 생리식염수에 녹여 1일 1회 7일간 둔부 근육 주사하였다. HA의 첫 근육주사 24시간 경과 후 7일간 정상군과 대조군은 멸균생리식염수를, GR 투여군은 20 mg/kg 농도로 zondef- 이용하여 경구투여하였으며, 양성대조군인 urokinase군은 2, 500 U/kg의 농도로 근육 주사하여 HA 유발 8일째에 채혈을 실시하였다. HA 및 약물을 최종 투여한 24시간 후 백서를 ether로 가볍게 마취시키고 심장 천자로 6ml의 혈액을 3.
- In Vivo endotoxin에 의한 혈전증 유발 실험 - 백서 5마리씩을 한 군으로 하여, 정상군, 대조군, urokinase 투여군 및 GR 투여군으로 각각 나누었다. 정상군에는 멸균 생리식염수를, GR 투여군은 20mg/kg 농도로 zonde를 이용하여 경구투여하고, urokinase 투여군은 urokinase 2, 500 U/kg을정맥주사하고, 1시간 후 Westphal 법16)에 의하여 정제한 endotoxin 0.
- In Vivo hydrocortisone acetate(HA에 의한 혈전증 유발 실험 - 백서 4마리를 1군으로 하여 정상군, 대조군, urokinase군 및 GR 투여군으로 각각 나누었다. 정상군은 생리식염수(0.
- 오배자의 항혈전작용을 탐색하기 위하여 collagen과 ADP를 이용하여 혈소판 응집억제효과를 탐색하고, in vivo에서 endotoxin과 HA에 의해서 유도된 병태 모델을 이용하여 혈소판수, prothrombin time(PT), activated partial thrombo plastin time(APTT) 및 fibrinogen의 양을 측정하였다. 그 결과 오배자는 collagen과 ADM 의해 유도된 혈소판응집을 농도의 존적으로 강한 저해효과를 나타내었다.
- GR 투여군으로 각각 나누었다. 정상군에는 멸균 생리식염수를, GR 투여군은 20mg/kg 농도로 zonde를 이용하여 경구투여하고, urokinase 투여군은 urokinase 2, 500 U/kg을정맥주사하고, 1시간 후 Westphal 법16)에 의하여 정제한 endotoxin 0.1 mg/kg을 백서의 꼬리정맥에 주사하여 Schoen- dorf 법17)에 준하여 혈전증을 유발시켰다. 단, 정상군은 멸균 생리식염수를 미정맥에 주사하여 동일한 스트레스를 가하여 실험조건을 동일하게 하였다.
- 및 GR 투여군으로 각각 나누었다. 정상군은 생리식염수(0.15 ml/300 g)를, 대조군과 GR 투여군 및 urokinase군은 HA(5 mg/kg)를 생리식염수에 녹여 1일 1회 7일간 둔부 근육 주사하였다. HA의 첫 근육주사 24시간 경과 후 7일간 정상군과 대조군은 멸균생리식염수를, GR 투여군은 20 mg/kg 농도로 zondef- 이용하여 경구투여하였으며, 양성대조군인 urokinase군은 2, 500 U/kg의 농도로 근육 주사하여 HA 유발 8일째에 채혈을 실시하였다.
대상 데이터
- 로서 한국화학연구소에서 체중 180-200 g의 수컷을 분양받아 시용하였다. (주)삼양사의 실험동물용 고형사료로 사육하였으며, 물은 충분히 공급하고 실온 22± 2℃를 계속 유지하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 시약 및 기기 -Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS-A), endotoxin, 3.8% sodium citrate는 Sigma 제품을, ADR collagen, thrombin reagent는 Chrono-Log 제품을, IL Test™ PT-fibrinogen HS, IL Test™ APTT Lyophilized silica는 Instrumentation Laboratory 제품을 각각 사용하였다. 실험기기로써 Whole Blood Lumi-Ionized Calcium aggre- gometer(Chrono-Log Co.
- 8% sodium citrate는 Sigma 제품을, ADR collagen, thrombin reagent는 Chrono-Log 제품을, IL Test™ PT-fibrinogen HS, IL Test™ APTT Lyophilized silica는 Instrumentation Laboratory 제품을 각각 사용하였다. 실험기기로써 Whole Blood Lumi-Ionized Calcium aggre- gometer(Chrono-Log Co., Ltd), centrifuge(Beckman Co.), freeze dtyer(Eyela Co.) 등을 사용하였다.
- 실험동물 - 본 실험에 사용된 rat는 체중 180-220g의 Sprague-Dawley계 로서 한국화학연구소에서 체중 180-200 g의 수컷을 분양받아 시용하였다. (주)삼양사의 실험동물용 고형사료로 사육하였으며, 물은 충분히 공급하고 실온 22± 2℃를 계속 유지하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용한 오배자(Galla Rhois)는 대전대학교 부속 한방병원과 대전시내의 건재도매상 두 곳에서 외부형태를 비교 검사 확인한 후 실험에 사용하였다.
이론/모형
- p.m으로 15분간 원심분리 시켜 싱층의 혈청을 serum separator에 취하여 coagulometer 측정기인 ACLlOO(Germany)을 이용하여 Hara 등18)의 방법으로 prothrombin time(PT), activated partial thrombopla stin time(APTT) 측정에 사용하였으며 혈소판수는 Roche hematology 기기로 측정하였다.
- m으로 20분간 원심분리하여 상등액을 platelet poor plasma(PPP)로 만들어 사용하였다. 혈소판 응집에 대한 실험은 Whole Blood Lumi-Ionized Calcium aggregometer(Chrono-Log Co., Ltd)를 사용하여 Bom등15)의 방법에 따라 탁도측정법으로 실시하였다. Cuvette에 PRP 400μl, collagen(50 μg/mZ) 50μl 또는 ADP (20μM/ml) 50 B, GR 50 W를 조심스럽게 넣고 혈소판 응집도를 관찰하였다.
성능/효과
- 08(%)로 농도의존적으로 강한 저해효과를 나타내었다(Table Ⅰ). ADP(20μg/ml)에 의한 혈소판 응집반응 저해효과에서는 GR 10, 100, 1, 000μg/ml의 농도에서 대조군에 비하여 각각 5.65+1.14%, 11.29+1.14%, 69.35±6.84%로 나타나 농도 의존적으로 저해효과를 나타내었다(Table Ⅰ). 이로 보아 오배자는 혈소판 응집 억제효과가 있는 것으로 사료된다.
- time(APTT) 및 fibrinogen의 양을 측정하였다. 그 결과 오배자는 collagen과 ADM 의해 유도된 혈소판응집을 농도의 존적으로 강한 저해효과를 나타내었다. 혈소판 수의 변화에서는 endotoxin과 HA 병태 모델 모두에서 대조군에 비하여 유의성있는 증가를 나타내었으며 , endotoxin 병태 모델에서는 PT가 대조군에 비하여 단축되었으나 유의성은 나타나지 않았고, HA 병태 모델에서는 대조군에 비하여 유의성 있는 단축을 나타내었다.
- 3(× 103/mm3)로 감소하였다. 이에 비해서 항응고제인 urokinase를 투여한 양성대조군에서는 791.0±54.7(×103/mm3)로 증가되었으며, GR 투여군 역시 혈소판 수가 777.2±38.5(x 103/mm3)로 대조군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다(Table Ⅱ, P<0.05). 한편, PT는 주로 외인계 응고 인자의 결핍 및 이상을 검출하는 검사로, 혈장에 조직 thromboplastin과 calcium을 첨가하면 fibrin으로 석출될 때까지의 시간을 말한다.
- 05). 한편, fibrinogen은 혈장중에 존재하는 응고인자로써 thrombin에 의해 분해되어 fibrin으로 전환되는데, 이는 염증, 악성종양, 신장 질환 및 당뇨병등에서 증가되고, 간실질장애로 인한 생산 저하와 소비항진이 있을 때는 감소하여 심근경색, 간질환, 괴저성손상 및 출혈성 질환의 예칙 및 치료에 유용하게 응용되는데, HA 병태 모델에서 대조군에 비하여 유의성는 증가를 나타내었다(Table Ⅲ, P<0.05). 이 결과는 앞서 기술한 혈소판수에 미치는 결과와 일치되어, 본 시료가 HA로 인해 혈소판이 응고인자로 작용한 것을 방지하는 동시에 혈액 응고인자의 고갈을 방지시키는 작용을 하였다고 볼 수 있다.
- 그 결과 오배자는 collagen과 ADM 의해 유도된 혈소판응집을 농도의 존적으로 강한 저해효과를 나타내었다. 혈소판 수의 변화에서는 endotoxin과 HA 병태 모델 모두에서 대조군에 비하여 유의성있는 증가를 나타내었으며 , endotoxin 병태 모델에서는 PT가 대조군에 비하여 단축되었으나 유의성은 나타나지 않았고, HA 병태 모델에서는 대조군에 비하여 유의성 있는 단축을 나타내었다. APTT는 endotoxin 병태 모델에서 대조군에 비하여 단축되었으나 유의성은 나타나지 않았으며, HA 병태 모델에서는 대조군에 비하여 유의성있게 단축되었다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 오배자는 혈전성 응고 요인들과 콜라겐 섬유에 의한 혈전 형성 억제 기전에 효과적으로 작용함을 알 수 있으며, 특히 HA 병태 모델에서의 결과는 혈액 점도 이상으로 야기되는 다양한 혈액 질환에 응용 가능할 것으로 보여, 향 후 분획을 통한 물질 분리 및 농도에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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