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문제 정의
- 그러나 지유의 품질을 평가할 수 있는 지표물질의 선정이나 이를 이용한 성분함량에 관한 연구는 보고된 바 없어 본연구자는 생약의 품질규격화 연구의 일환으로 지유의 약효성분이면서 함량이 비교적 많고 HPLC로 정량이 가능한 성분을 지표성분으로 한 지유의 성분분석법을 확립하고, 실제지유 중의 지표성분의 함량, 건조감량, 회분 및 산불용성회분을 정량하여 지유의 품질관리 기준을 설정하고자 한다.
- 국내 시판되고 있는 지유에 대한 품질 표준화 연구의 일환으로 지유의 약효성분이면서 함량이 비교적 많고 HPLC 로 정량이 가능한 성분을 지표성분으로 하여 지유의 성분분석법을 확립하고, 실제 지유 중의 지표성분의 함량, 건조감량, 회분 및 산불용성회분을 정량하여 지유의 품질관리기준을 설정하고자 하였다.
제안 방법
- 건조감량시험 - 무게를 단 칭량병에 시료 2~6g을 넣어무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 5시간 건조하고, 데시케이터에서 방냉한 후 그 무게를 정밀하게 측정하였다. 이것을 다시 105℃에서 1시간마다 무게를 측정하여 항량이되었을 때의 감량을 건조감량(%)으로 하였다.
- 시료 2~4 g을 사기도가니에 넣어 무게를 정밀하게 측정한 후회화로에 넣어 서서히 온도를 올리면서 550℃에서 4시간이상 가열하여 탄화물이 남지 않을 때까지 회화하여 데시케이터에서 방랭한 다음 무게를 정밀하게 측정하여 회분량 (%)으로 하였다.
- 건조한다. 무게를 정밀하게 측정한 사기도가니에서 3 시간 강열(550℃)하여 데시케이터에서 방랭한 후 그 무게를정밀하게 측정하여 산불용성회분량(%)으로 하였다.
- 지표성분의 분리 및 동정 - 지유(4.0 kg)을 MeOH로 15 일간 실온에서 3회 반복 추출, 여과 및 감압 농축하여 MeOH 엑스를 제조하였다. MeOH 추출물을 증류수로 현탁시킨 다음 동량의 methylene chloiidefCHQz)를 가하여 진탕하고분획(3회)하여 CH2C&층으로 하였다.
- 검액의 조제 - 검체 2.0 g을 정확히 평량하여 methanol 15mZ를 가해 30분간 초음파 진탕한 후 3000rpm에서 원심분리후에 추출액을 얻고, 잔사를 총 3회 추출하였다. 추출액을 모두 합하여 methanol 5 가하여 정확히 50 m/를만들어 0.
- 45 |im mernerane filter로 여과한 여액을 검액으로사용하였다. 각각의 검액을 10씩 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram의 면적을 구하여 회귀직선 방정식으로부터각각의 지표물질의 함량을 구하였다(Fig. 2).
- 3). 각종 spectral data와 문헌을 비교 검토한 결과 compound 1은 ziyuglycoside I으로 확인되어 지유의 HPLC 로 정 량이 가능한 지표성분을 ziyuglycoside I으로 선정하고 표준품을 확보하였다.
- 0에 접근하였다. 이와 같은 조건에서 전국 각지에서 구입한 지유 30종의 ziyuglycoside I 함량을 시험하여 건조중량(g)중의 함량을 구하여 %를 산출하였다(Table I). 지유중의 ziyuglycoside I 함량의 평균 및 표준편차는 3.
- 1. 지유 4.0 kg을 MeOH로 15일간 실온에서 3회 반복 추출, 여과 및 감압 농축하여 얻은 MeOH 추출물을 증류수로현탁 시킨 다음 CJ&CL EtOAc 및 "-BuOH로 3회 용매분획하였다. EtOAc 분획물을 감압농축 후 ODS gel을 사용한 column chromatography를 실시하여 ziyuglycoside I을 분리, 동정하였다.
- 0 kg을 MeOH로 15일간 실온에서 3회 반복 추출, 여과 및 감압 농축하여 얻은 MeOH 추출물을 증류수로현탁 시킨 다음 CJ&CL EtOAc 및 "-BuOH로 3회 용매분획하였다. EtOAc 분획물을 감압농축 후 ODS gel을 사용한 column chromatography를 실시하여 ziyuglycoside I을 분리, 동정하였다.
- 표준액의 조제 - Ziyuglycoside I 2.4 mg을 HPLC용 methanol 2ml에 녹이고 이것을 stock solution으로 하여 37.5, 75, 150, 300, 600, 1200로 단계적으로 희석하여 검액을 만들어 검량용 표준용액으로 하였다. 각각의 표준용액 10를 HPLC로 분석하여 chromatogram의 면적을 구하고 이들의 면적과 표준용액의 농도를 변수로 한 검량선을 작성하여 얻은 회귀직선 방정식은 y=3476.
대상 데이터
- 실험재료 - 본 연구에 사용한 지유는 2001년 9월 국내에서 판매되는 30종을 구입하여 분쇄한 후 시료로 사용하였다.
- 시약 및 기기 - Column chromatoraphy, silica gele Kieselgel 60(70-230 mesh, Merck), ODS(Lichroprep RP- 18, Merck)를 사용하였고, TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (Meick)와 RP-18 F254$(M3ck)를 사용하였다. 시약과 용매는 특급 또는 1급 시약을 사용하였으며, HPLC용 용매는 HPLC grade(Merck)를 사용하였다.
- RP-18 F254$(M3ck)를 사용하였다. 시약과 용매는 특급 또는 1급 시약을 사용하였으며, HPLC용 용매는 HPLC grade(Merck)를 사용하였다. Negative-ion FAB-Mass (matrix: mNBA)는 VG70-VSEQ(Enand)를, 및 13C- NMRe Broker AM-500(Germany)< 사용하였으며 HPLC는 Shimadzu LC-lOAyp System Controller, LC-10Arw Pump, SPD-lOAyp UV-VIS Detector, SIL-10ADVP Auto Injector (Japan)를 사용하였다.
- 시약과 용매는 특급 또는 1급 시약을 사용하였으며, HPLC용 용매는 HPLC grade(Merck)를 사용하였다. Negative-ion FAB-Mass (matrix: mNBA)는 VG70-VSEQ(Enand)를, 및 13C- NMRe Broker AM-500(Germany)< 사용하였으며 HPLC는 Shimadzu LC-lOAyp System Controller, LC-10Arw Pump, SPD-lOAyp UV-VIS Detector, SIL-10ADVP Auto Injector (Japan)를 사용하였다. 회화로는 Bamstead Thermolyne사의 F4800 F* urnace 사용하였다.
- Negative-ion FAB-Mass (matrix: mNBA)는 VG70-VSEQ(Enand)를, 및 13C- NMRe Broker AM-500(Germany)< 사용하였으며 HPLC는 Shimadzu LC-lOAyp System Controller, LC-10Arw Pump, SPD-lOAyp UV-VIS Detector, SIL-10ADVP Auto Injector (Japan)를 사용하였다. 회화로는 Bamstead Thermolyne사의 F4800 F* urnace 사용하였다.
- HPLC법을 이용하여 정량하였다. Column으로는 Luna C]g (4.6 x 250 mm, 5 μm, Phenomenex)를 사용하였고 이동상으로는 CH3CN : H2O = 33 : 67(v/v)이 되도록 하였다. 유속은 1.
이론/모형
- 지유의 지표물질인 ziyuycoside I의 함량을 측정하기 위하여 HPLC법을 이용하여 정량하였다. Column으로는 Luna C]g (4.
성능/효과
- 1H-NMR spectrum에서 8 0.94, 0.99, 1.22, 1.29, 1.42, 1.72 ppm에서 6개의 tertiaiy methyl에 기 인하는 signal0] singlet&S, 6 1.09 ppm에서 1 개의 secondary methyl에 기인하는 signal이 doublet(J=6.4 Hz, C2°Me)로 관찰되었으며, 5 5.58 ppm에서 ethylenic proton(H-12)에 기인하는 signal이 brs로 나타나고 52.96 ppm에서 H-18에 기인하는 signal0] singlet으로 관찰되어 C-19에 치환기가 결합되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 84.
- 96 ppm에서 H-18에 기인하는 signal0] singlet으로 관찰되어 C-19에 치환기가 결합되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 84.78(d, J=6.9Hz)과 6.34(d, J=8.0 Hz) ppm에서 arabinose와 glucose의 anomeric proton을 확인할 수 있어 2개의 당이 결합되어 있음을 확인할 수 있었다.
- , 3C-NMR spectrum에서는 5 128.9과 139.7 ppm에서 C-12 와 C-13에 기인하는 ethylenic signal을 확인할 수 있어, urs- 12-en skeleton을 이루고 있고 6 96.3과 108.0 ppm에서 glucosee- arabinose의 anomeric carbon을 확인할 수 있었다.
- 이상의 기기분석 결과 문헌과의 비교로 Compound 1 은 ziyuglycoside I으로 확인, 동정하였다.
- 또한 산불용성회분 시험에서 평균 및 표준편차는 1.034±0.466%(n=30)로 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해(1)에규정하고 있는 1.5% 이하 보다 적었으며 시료에 따라 0.408% ~2.512%로 차이를 보였으나 시료 3개를 제외하면 지유의산불용성 회분함량은 1.5% 이하이므로 산불용성 회분함량 규정을 1.5% 이하로 하면 타당하리라 생각된다.
- 0m"min으로, UV Detector 파장은 203 nm에서 고정하여 실시하였다. 지표물질을 사용하여 검량선을 작성한 결과 37.5~1200 의 농도에서 직선성이 인정되었으며 회귀직선 방정식은 y=3476J92x+17160.905이고 상관계수는 0.9999로서 1.0에 접근하였다. 이와 같은 조건에서 전국 각지에서 구입한 지유 30종의 ziyuglycoside I 함량을 시험하여 건조중량(g)중의 함량을 구하여 %를 산출하였다(Table I).
- 이와 같은 조건에서 전국 각지에서 구입한 지유 30종의 ziyuglycoside I 함량을 시험하여 건조중량(g)중의 함량을 구하여 %를 산출하였다(Table I). 지유중의 ziyuglycoside I 함량의 평균 및 표준편차는 3.005±1.434%(n=30)이었고 함량이 매우 낮은 3개를제외하면 모두 1.5% 이상의 ziyuglycoside I을 함유하고 있으므로 지유의 표준화를 위한 ziyuglycoside I의 함량은 1.5% 이상으로 규정하는 것이 타당하다고 생각된다.
- 2. 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해에는 건조감량을 16.0% 이하로 규정하고 있는데 30개의 시료에 대한 건조감량시험 결과, 평균 및 표준편차는 8.246± 1.305%로 시료에따라 5.656%~11.067%로 차이를 보였으나 시료 모두 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해4)에 규정하고 있는 16.0% 이하였다. 따라서 지유의 건조감량은 16% 이하로 규정하면타당하리라 생각된다.
- 3. 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해에는 회분함량을 7.0% 이하로 규정하고 있는데 42개의 시료에 대한 회분시험 결과, 평균 및 표준편차는 10.711 ±3.204%로 대한약전및 대한약전외 한약규격주해에 규정하고 있는 7.0% 이하보다는 많았으며 시료에 따라 3.985%~17.932%로 차이를보였으나 시료 3개를 제외하면 지유의 회분함량은 15.0% 이하이므로 회분함량 규정을 15.0% 이하로 하면 회분 함량은 15.0% 이하로 하면 타당하리라 생각된다.
- 4. 대한약전 및 대한약전외 한약규격주해에는 산불용성 회분함량을 1.5% 이하로 규정하고 있는데 30개의 시료에 대한 산불용성회분 시험 결과, 평균 및 표준편차는 1.034±0.466%로 대한약전에 규정하고 있는 1.5% 이하 보다 적었으며 시료에 따라 0.408%~2.512%로 차이를 보였으나 시료 3개를 제외하면 지유의 산불용성회분함량은 1.5% 이하이므로 산불용성회분함량 규정을 1.5% 이하로 하면 타당하리라생각된다.
- 5. 지유의 주성분인 ziyuglycoside I을 지표물질로 하여 HPLC 방법을 확립하여 시료 30종의 ziyuglycoside I 함량을 시험한 결과, 평균 및 표준편차는 3.005土 1.434%이었다. 함량이 매우 낮은 3개를 제외하면 모두 1.
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