During the screening of inhibitors of caspase-3 induction in U937 human monocytic leukemia cells from natural sources, Forsythiae fructus, which showed a high level of inhibition, was selected. And then, the compound was purified from the methanol extract using silica gel column chromatography and H...
During the screening of inhibitors of caspase-3 induction in U937 human monocytic leukemia cells from natural sources, Forsythiae fructus, which showed a high level of inhibition, was selected. And then, the compound was purified from the methanol extract using silica gel column chromatography and HPLC. The inhibitor was identified as rengyolone, by spectroscophic methods of ESI-MS, $^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$, DEPT, and HMBC. Rengyolone showed inhibitory activity of caspase-3 induction, a major protease of apoptosis cascade, with an $IC_{50}$ value of $6.25\;{\mu}g/mL$ after 7 h of treatment in U937 cells. It also showed inhibitory activity of caspace-1 induction, with an $IC_{50}$ value of $7.50\;{\mu}g/mL$ after 40 h of treatment in D10S cells. In addition, it showed protective effect against cell death with an $IC_{50}$ value of $11\;{\mu}g/mL$ on U937 cells induced by etoposide after 24 h of treatment, but did not show any cytotoxicity at the same condition without etoposide, a caspase 3 inducing agent.
During the screening of inhibitors of caspase-3 induction in U937 human monocytic leukemia cells from natural sources, Forsythiae fructus, which showed a high level of inhibition, was selected. And then, the compound was purified from the methanol extract using silica gel column chromatography and HPLC. The inhibitor was identified as rengyolone, by spectroscophic methods of ESI-MS, $^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$, DEPT, and HMBC. Rengyolone showed inhibitory activity of caspase-3 induction, a major protease of apoptosis cascade, with an $IC_{50}$ value of $6.25\;{\mu}g/mL$ after 7 h of treatment in U937 cells. It also showed inhibitory activity of caspace-1 induction, with an $IC_{50}$ value of $7.50\;{\mu}g/mL$ after 40 h of treatment in D10S cells. In addition, it showed protective effect against cell death with an $IC_{50}$ value of $11\;{\mu}g/mL$ on U937 cells induced by etoposide after 24 h of treatment, but did not show any cytotoxicity at the same condition without etoposide, a caspase 3 inducing agent.
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문제 정의
본 연구에서는 apoptosis 조절물질을 탐색하고자 보유하고 있던 한약재 55종의 methanol 추출물을 대상으로 apoptosis 유도물질의 하나인 etoposide를 이용하여 U937 세포주의 apoptosis를 유도한 후 apoptosis 정도를 caspase-3와 caspase-1의 활성을 측정하였으며, 그 결과 저해활성이 우수한 연교를 선발한 후 저해물질을 정제하고, 구조결정 및 저해활성을 조사하였는 바 그 결과를 보고한다.
제안 방법
측정하였다. 96-well microplate에 U937 세포, etoposide 및 시료를 첨가하여 24시간 배양하였으며, 세포 사멸 정도율은 MTS 시약을 첨가한 1시간 후에 UV 490nm에서 측정한 OD값으로 환산하였다(21).
D10S T-helper cell을 RPMI-1640 배지(5% FBS와 5 µM 2- mercaptoethanol 첨가)를 이용하여 5% CO2 incubator에서 48시간 배양 후, 96-well microplate에 sample과 Interleukin-Iβ를 1 ng/mL로 처리하여, 40시간 후 cell의 상태를 현미경으로 관찰하여 caspase-1의 활성을 1차적으로 판단 후, 세포를 harvest하여 얻은 lysate를 이용하여 YVAD-AFC(Thr-Val-Ala-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin)를 기질로 100µL의 buffer[100 mM N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N-2(2-ethane-sulfonic acid)(HEPES), pH 7.5, 10 mM dithiothreitol(DTT), 10% sucrose, 0.1% CHAPS, and 0.1% BSA at 25℃]와 혼합하여 25℃에서 반응시켰다. AFC의 생성은 spectrofluorometer(Perkin-Elmer LS-50B)를 사용하여 측정하였다(20).
4). Rengyolone의 caspase-3 유도저해활성이 etoposide에 의한 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 확인하기 위해, etoposide(10 µg/mL, 24 h)에 의해 유도된 apoptosis 조건에서 U937 세포의 cell viability를 MTS assay로 측정하였다(Fig. 5). Rengyolonee etoposide에 의해 24시간 동안 유도된 U937 human leukemia cell의 apoptosis를 농도 의존적으로 저해하여 세포의 사멸을 저해하는 것으로 확인되었다.
U937 세포를 RPMI-1640배지(10% FBS)를 이용하여 5% CO2 incubator에서 배양 후, 96-well microplate에 sample을 처리하고 10µg/mL의 etoposide로 apoptosis를 유도한 후 5시간 후에 현미경으로 cell의 모양을 상태를 관찰하여 apoptosis 여부를 1차 판정하였으며, 세포를 harvest 한 후 얻은 lysate를이용하여 caspase-3의 활성을 형광합성 기질인 5mM의 DEVD-AFC(Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethyl coumarin)을 100µL의 buffer[100 mM N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N-2(2-ethanesulfonic acid)(HEPES), pH 7.5, 10 mM dithiothreitol(DTT), 10% sucrose, 0.1% CHAPS, and 0.1% BSA at 25℃]와 혼합하여 25℃에서 반응시켰다. AFC의 생성은 spectrofluorometer(Perkin-Elmer LS-50B)를 사용하여 측정하였다(20).
연교 600 g을 실온에서 methanol로 2회 추출하고 여과한 methanol 추출액을 감압 농축한 후 증류수에 현탁하여 ethyl acetate로 추출하였다. 추출물을 silica gel column chromatography를 실시하여 각 fraction의 caspase-3 유도 저해 활성을 측정하였다.
연교의 메탄올 추출물로부터 caspase 저해물질을 분리하였으며, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 등의 기기분석 자료에 의하여 rengyolone으로 동정하였다. 이 물질은 IC50 6.
저해물질을 Sephadex LH-20(Pharmasia LKB, Sweden), ODS-AM HPLC column(250 X 4.6 mm, YMC Co., Japan) 등을 사용하여 분리하였다. HPLC는 Hitachi사(Japan)의 L-6200 intelligent pump, L-6000 pump, L-4000 UV detector를 사용하였다.
추출하였다. 추출물을 silica gel column chromatography를 실시하여 각 fraction의 caspase-3 유도 저해 활성을 측정하였다. 활성분획을 모은 후, 이 추출물을 sep-pak C18 cartridge(Waters, 5 g에 통과, 흡착시키고, 증류수로 수세한 후 MeOH:H2O을 이용하여 단계별로 용출하였다.
대상 데이터
, Japan) 등을 사용하여 분리하였다. HPLC는 Hitachi사(Japan)의 L-6200 intelligent pump, L-6000 pump, L-4000 UV detector를 사용하였다.
측정하였다. NMR 스펙트럼는 Varian UNITY 300(USA)를 이용하여, 용매로는 CD3OD를 사용하였다.
각 정제단계 및 column chromatography에 사용된 메탄올, 에틸아세테이트 등의 용매는 일반 시약을, HPLC 용매는 Baxter(Burdick & Jackson, USA), Merck 제품을 사용하였다. NMR용 CD3OD 등은 Aldrich사(USA) 제품을 사용하였다. 세포배양에 사용된 시약류는 Gibco BRL 제품을 사용하였으며, caspase assay에 사용된 기질 및 저해제 등은 Enzyme System Products(USA) 제품을 사용하였다.
물질분리 및 확인에 사용한 silica gele Merck사(Germany)의 silica gel 60(63-200 µm)을, TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC columne YMC사(Japan), Phenomenex사(USA)의 제품을, Sephadex LH-20은 Pharmacia(Sweden) 제품을 각각 사용하였다. 각 정제단계 및 column chromatography에 사용된 메탄올, 에틸아세테이트 등의 용매는 일반 시약을, HPLC 용매는 Baxter(Burdick & Jackson, USA), Merck 제품을 사용하였다. NMR용 CD3OD 등은 Aldrich사(USA) 제품을 사용하였다.
물질분리 및 확인에 사용한 silica gele Merck사(Germany)의 silica gel 60(63-200 µm)을, TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC columne YMC사(Japan), Phenomenex사(USA)의 제품을, Sephadex LH-20은 Pharmacia(Sweden) 제품을 각각 사용하였다. 각 정제단계 및 column chromatography에 사용된 메탄올, 에틸아세테이트 등의 용매는 일반 시약을, HPLC 용매는 Baxter(Burdick & Jackson, USA), Merck 제품을 사용하였다.
NMR용 CD3OD 등은 Aldrich사(USA) 제품을 사용하였다. 세포배양에 사용된 시약류는 Gibco BRL 제품을 사용하였으며, caspase assay에 사용된 기질 및 저해제 등은 Enzyme System Products(USA) 제품을 사용하였다.
실험에 사용한 무기염류 및 일반 용매는 시약특급을 사용하였고, 배양에 사용한 배지류는 주로 Difco(USA)제품을 사용하였다. 물질분리 및 확인에 사용한 silica gele Merck사(Germany)의 silica gel 60(63-200 µm)을, TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC columne YMC사(Japan), Phenomenex사(USA)의 제품을, Sephadex LH-20은 Pharmacia(Sweden) 제품을 각각 사용하였다.
이론/모형
1% BSA at 25℃]와 혼합하여 25℃에서 반응시켰다. AFC의 생성은 spectrofluorometer(Perkin-Elmer LS-50B)를 사용하여 측정하였다(20).
Mass 스펙트럼는 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였다. NMR 스펙트럼는 Varian UNITY 300(USA)를 이용하여, 용매로는 CD3OD를 사용하였다.
세포 사멸율은 microculture tetrazolium assay(MTS)법을 사용하여 측정하였다. 96-well microplate에 U937 세포, etoposide 및 시료를 첨가하여 24시간 배양하였으며, 세포 사멸 정도율은 MTS 시약을 첨가한 1시간 후에 UV 490nm에서 측정한 OD값으로 환산하였다(21).
성능/효과
ESI-MS분석 결과 m/z 155에서 (M+H)+ 피이크가 관찰되어 분자량 154로 확인되었다, 13C-NMR과 DEPT NMR data 분석 결과 40.38(CH2), 40.54(CH2), 67.1(CH2), 82.3(CH), 128.8(CH), 150.7(CH), 75.55, 199.1 ppm에서 8개의 carbon peaks가 관찰되었다. 1H-NMR spectrum으로부터 2.
3). IL-1 의존적인 D10S 세포에서 Interleukin-β에 의한(10 ng/mL, 40 hrs) caspase-1의 유도를 저해하는 활성을 측정한 결과, IC50 값은 7.50 µg/mL이었다(Fig. 4). Rengyolone의 caspase-3 유도저해활성이 etoposide에 의한 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 확인하기 위해, etoposide(10 µg/mL, 24 h)에 의해 유도된 apoptosis 조건에서 U937 세포의 cell viability를 MTS assay로 측정하였다(Fig.
5). Rengyolonee etoposide에 의해 24시간 동안 유도된 U937 human leukemia cell의 apoptosis를 농도 의존적으로 저해하여 세포의 사멸을 저해하는 것으로 확인되었다. 또한 동일한 조건에서 etoposide에 의한 자극 없이 rengyolone의 세포 독성을 측정하여 본 결과 100 µg/mL 이상의 IC50 값을 나타내어 비교적 낮은 세포독성을 나타내었다(Fig.
Rengyolonee etoposide에 의해 24시간 동안 유도된 U937 human leukemia cell의 apoptosis를 농도 의존적으로 저해하여 세포의 사멸을 저해하는 것으로 확인되었다. 또한 동일한 조건에서 etoposide에 의한 자극 없이 rengyolone의 세포 독성을 측정하여 본 결과 100 µg/mL 이상의 IC50 값을 나타내어 비교적 낮은 세포독성을 나타내었다(Fig. 6).
에서 caspase-1은 caspase-3를 activate한다고 보고하는 등 apoptosis 조절활성은 caspase-1과 caspase-3에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 이러한 결과를 바탕으로 rengyolone의 caspase 유도저해활성은 신경관련 질환 등을 조절할 것으로 추정된다.
한약재 55종의 methanol 추출물을 대상으로 etoposide를 이용하여 U937세포주의 apoptosis를 유도한 후 apoptosis 정도를 caspase-3와 caspase-1의 활성을 측정한 결과, 최종적으로 연교를 선발한 후 저해물질을 분리하였다.
후속연구
이번 실험에 의해 분리된 rengyolonee 연교에서 이전에 분리 보고된 물질이나, rengyolone의 caspase 유도저해활성을 나타내는 성분으로는 본 실험에 의해 처음 밝혀졌으며, 그 작용기작에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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