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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 대원제약 주식회사가 시판하고 있는 레보설피리드 제제인 "레보피드 정"이 SK제약 주식회사의 레보설피리드 제제인 "레보프라이드 정"과 그 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 생물학적 동등성 시험기준2)에 따라 건강한 성인 남자(만 19~36세) 28명을 대상으로 라틴 방격법에 따라 생체내 이용률 시험을 한 후, 얻어진 레보설피리드의 혈청 중 약물농도 · 시간곡선하 면적(AUCt), 최고 혈청 중 농도(Gnax)와 최고 혈청 중 농도 도달시간(Tmax)에 대하여 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax는 로그변환한 후 통계검정과 분산분석(ANOVA, analysis of variance)을 통하여 생물학적 동등성을 비교 판정하였다. 아울러, "레보프라이드 정"과 "레보피드 정"에 대하여 대한약전 제 7개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교용출시험을 행하였다.
- 약물의 용출은 생체이용률과 깊은 상관관계가 있으므로 먼저 용출시험을 행하여 대조약 및 시험약이 생물학적으로 동등할 것인지를 추정하고자 하였다. 즉, 동일성분을 동일량 함유하는 제제라 하더라도 원료, 부형제 및 제조공정 등에 따라 약물흡수의 전제조건이 되는 용출률이 다르게 나타날 수 있으므로 대조약과 시험약의 용출률을 비교하기 위하여 비교 용출시험을 행하였다.
- 그러나 제 Ⅱ기 때 중도탈락자 1명이 발생하여 제 Ⅱ기에서는 제 2군 피험자 13명에게만 투여하였다. 한편, 레보설피리드의 최종상의 반감기는 경구투여시 6 내지 19시간으로 보고되어 있어1) 생물학적 동등성 시험기준 제 18조 제 4항 휴약기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약기간을 두고자 6일로 하였다.
제안 방법
- 대원제약 주식회사가 시판하고 있는 레보설피리드 제제인 "레보피드 정"이 SK제약 주식회사의 레보설피리드 제제인 "레보프라이드 정"과 그 생체이용률에 있어서 통계학적으로 동등하다는 것을 입증하기 위해서 식품의약품안전청이 고시한 생물학적 동등성 시험기준2)에 따라 건강한 성인 남자(만 19~36세) 28명을 대상으로 2기 2제 라틴 방격법에 따라 시험하여 얻은 레보설피리드의 Tmax와 로그변환한 AUCt 및 Cmax에 대하여 통계검정과 분산분석을 행하였다. 또한 대한약전 제 7개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교 용출시험을 행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 대조약 "레보프라이드 정"과 시험약 "레보피드 정" 각 6정씩을 취하여 대한약전 제 7개정 용출시험법중 제 2 법(패들법)에 따라 37±0SC에서 50 rpm으로 시험하였다. 용출액은 용출시험 조건에 따라 제 1액(pH 1.
- 약물 투약은 2시기 2제품의 라틴 방격법에 따른 교차 시험법으로 투약계획을 세우고 28명의 피험자를 군당 14인씩 임의로 A, B 2군으로 나누고 제 Ⅰ기 때 A군에는 대조약인 "레보프라이드 정"을, B군에는 시험약인 "레보피드 정"를 투여하였고 제 Ⅱ기 때에는 그 반대로 투여하였다. 그러나 제 Ⅱ기 때 중도탈락자 1명이 발생하여 제 Ⅱ기에서는 제 2군 피험자 13명에게만 투여하였다.
- 240ml의 물과 함께 복용시켰다. 다음 각 피험자로부터 투약직전, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24 및 36 시간(총 12시점)에 약 5mZ의 혈액을 채취하여 혈구 분리용 원심 분리 관에 넣고 3000rpm에서 20분간 원심분리한 후 즉시 혈청 분리관을 사용하여 혈청을 채취하고 분석시까지 영하 70℃에서 보관하였다.
- 레보설피리드 표준품을 메탄올에 녹여 농도를 1000㎍/ml로 만든 후 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 blank 혈청으로 희석하여 레보설피리드의 혈청 중 농도가 각각 0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 및 100ng/ml 되도록 검량 선용 표준 혈청액을 조제하였다. 각각의 검량선용 표준혈청액 1.
- 5 M NaOH 20μl를 가하고 이 용액 50μl를 취하여 HPLC에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피이크 면적에 대한 래보설피리드의 피이크 면적비를 구하여 검량선을 작성하였으며 하루에 실험을 5번 시행하여 일내 재현성을 구하였고 연속하여 5일간 실험을 행하여 일간 재현성을 구하였을 뿐만 아니라 2, 10, 50 ng/m/ 농도에서 각각 5회 측정하여 정확성을 평가하고 상기 농도에서 물에 대한 평균 추출율을 구하였다.
- 용출액은 용출시험 조건에 따라 제 1액(pH 1.2), pH 4.0 시험액, 제 2액 (pH 6.8) 및 물 900 ml 각각 사용하여 5, 10 분(pH 1.2, 4.0 시험액), 15분(pH 6.8 시험액), 30, 45, 60, 90분(물)에 용출액을 채취하고 0.4㎛ 멤브레인 필터로 여과시킨 다음 차외선/가시부 분광광도계(291 nm)를 사용하여 흡광도 측정법에 따라 용출률을 산출하였다.
- 82세)이었다. 이들로부터 동의서를 받은 후 생물학적 동등성 시험을 실시하였다.
- 05에서 분산분석을 실시하여 순서효과(sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인간의 유의성 여부를 검토하였고, 90% 신뢰한계를 구하였다. 이때 Cmax와 Tmax는 실측치를 사용하였으며 AUCt는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 통상의 방법에 따라 구해 사용하였다. 한편, 제 Ⅱ기 제 2군에서 중도탈락자가 1명 발생한 것을 고려하여 14×13으로 통계처리를 실시하였다.
- 것인지를 추정하고자 하였다. 즉, 동일성분을 동일량 함유하는 제제라 하더라도 원료, 부형제 및 제조공정 등에 따라 약물흡수의 전제조건이 되는 용출률이 다르게 나타날 수 있으므로 대조약과 시험약의 용출률을 비교하기 위하여 비교 용출시험을 행하였다.
- 피험자들 모두에게 heparin-locked(150 unit/mi) Angioca- theter(JELCO™, 22G, Johnson&Johnson Medical, Pomezia, Italia)를 팔 정맥부위에 설치하고 대조약 또는 시험약 각각 1정씩을 240ml의 물과 함께 복용시켰다. 다음 각 피험자로부터 투약직전, 0.
- 이때 Cmax와 Tmax는 실측치를 사용하였으며 AUCt는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 통상의 방법에 따라 구해 사용하였다. 한편, 제 Ⅱ기 제 2군에서 중도탈락자가 1명 발생한 것을 고려하여 14×13으로 통계처리를 실시하였다.
- 한편, 혈청 시료의 분석은 먼저 피험자로부터 각 시간별로 채취하여 영하 70℃에 보관했던 혈청 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 3초간 진탕한 다음 이 혈청 1.0ml를 취하여 시험관에 옮기고 여기에 내부표준물질로 tiapride 메탄올 용액(lμg/ml) 100 μl, 0.1 M NaOH 용액 200μl 및 0.1 M sodium borate(pH 8.5) 200μl를 가한 후 상기 검량선 작성을 위한 추출법에 따라 추출하여 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피이크 면적에 대한 레보설피리드의 피이크 면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈청 시료 중 레보설피리드의 농도를 산출하였다.
- 혈청 중 레보설피리드 함량은 이미 보고된 레보설피리드 HPLC 분석법 3-5)을 참고, 다소 수정하여 상기 기기 조건하실온에서 이동상으로는 아세토니트릴 :0.01 M KH2PO4 (30:70, v/v)(pH 8.5)의 혼합용액을 사용하였으며 유속 0.8 mZ/min, 주입량 50μl 및 형광 검출기 (excitation: 300 nm, emission: 365nm)를 이용하여 정량하였고 다음과 같이 검량선을 작성하였다.
대상 데이터
- 시험에 사용된 시험 약은 식품의 약품안전청으로부터 허가를 받아 대원제약 주식회사(서울)에서 시판하고 있는 "레보피드 정"(제조번호: B013, 제조일자: 2001. 12. 11, 레보설피리드 25 mg), 대조약은 SK제약 주식회사서울)에서 시판하고 있는 "레보피드 정"(제조번호: 03501, 사용기한: 2006. 7. 16)으로 레보설피리드를 25 mg 함유하는 정제이었다.
- 공고를 통하여 모집하였다. 35명의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였다. 이들 중 전남대학교 병원(광주)에서 전문외사의 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정된 자 28인을 선정하였다.
- 제 Ⅱ기 때에는 그 반대로 투여하였다. 그러나 제 Ⅱ기 때 중도탈락자 1명이 발생하여 제 Ⅱ기에서는 제 2군 피험자 13명에게만 투여하였다. 한편, 레보설피리드의 최종상의 반감기는 경구투여시 6 내지 19시간으로 보고되어 있어1) 생물학적 동등성 시험기준 제 18조 제 4항 휴약기간의 산정기준에 따라 충분한 휴약기간을 두고자 6일로 하였다.
- 통과시킨 것을 사용하였다. 디클로로메탄, 인산이수소칼륨, 수산화나트륨 및 기타 시약들은 1급시약들을 사용하였다.
- 레보설피리드 표준품은 대원제약으로부터 제공받았으며, 내부표준물질로 사용한 tiapride는 Sigma(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, 미국)로부터 구입하였다. HPLC용 아세토니트릴, 메탄올(이상 Fisher Scientific Co.
- 용출시험용 기기로는 용출기(KD6, 국제엔지니어링, 한국), 자외선/가시부 분광광도계(UV-2401PC, Shimadzu, Ibkyo, 일본)를 사용하였으며, 약물분석 기기로는 HPLC용 펌프(LC 10AD, Shimadzu, Tokyo, 일본), LUNA C18⑵(입자경 5 μm, 250 mtn x 4.6 mm, Phenomenex Co., CA, 미국), 형광 검출기(RF10AXL, Shimadzu, Tbkyo, 일본), 주입기(Model 7725, Rheodyne, Cotati, CA, 미국), 적분계 (Model Class LC-10, Shimadzu, 일본), 원심분리기 (UNION 55R, Hanil Science Industrial Co., 인천, 한국) 및 탁상용 혼합기 (G560, Scientific Co., Bohemia, NY 미국)를 사용하였다.
- 35명의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였다. 이들 중 전남대학교 병원(광주)에서 전문외사의 건강진단을 실시하여 건강인으로 판정된 자 28인을 선정하였다. 피험자로 선정된 사람들의 평균 체중은 69.
- 피험자는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적 동등성 시험 기준2)에 근거하여 만 19~55세의 건강한 성인 남성 지원자를 공고를 통하여 모집하였다. 35명의 지원자가 이 시험에 대한 설명회에 참석하였다.
데이터처리
- "레보프라이드 정" 및 "레보피드 정"을 각각 1정씩 28명의 지원자에게 라틴 방격법에 따른 교차시험법에 따라 경구투여하여 얻은 칵 제품의 혈청 중 약물농도-시간 곡선으로부터 약물속도론적 파라미 터인 AUCt, Cmax 및 Tmax를 구하였으며, 이들 두 제품에서 각각 얻은 값에 대해 Tmax를 제외한 AUCt와 Cmax의 로그변환치를 생물학적 동등성 시험통계처리용 프로그램인 Equiv Test6)를 이용하여 유의수준 α=0.05에서 분산분석을 실시하여 순서효과(sequence effect)를 검증한 후, 각 변동요인간의 유의성 여부를 검토하였고, 90% 신뢰한계를 구하였다. 이때 Cmax와 Tmax는 실측치를 사용하였으며 AUCt는 사다리꼴 면적계산 공식을 이용하여 최종 채혈시점까지의 값을 통상의 방법에 따라 구해 사용하였다.
- 또한, 각 피험자에 대해 대조약과 시험약을 투여하여 얻은 혈청 중 약물농도-시간곡선으로부터 산출한 약물속도론적 파라미터(AUCt, Cmax 및 Tmax)를 Table Ⅱ에 나타내었다. 대조약인 "레보프라이드 정"의 평균 AUCt(ng . hr/ml)는 521.56±168.31, 시험약인 "레보피드 정"은 528.40±156.22로 대조약에 대한 평균치 차가 -1.17%이었고, Cmax(ng/inZ)는 42.22±16.46과 46.21 ± 20.36으로 1.20%의 차이를 보였으며 Tmax(hr)는 4.38±1.60과 3.69±1.31로 -1.09%의 차이를 나타내 대조약에 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20% 이내 이어야 한다는 생물학적 동등성 평가를 위한 전제 조건을 만족하였으므로 이하 분산분석을 행하였다.
이론/모형
- "레보프라이드 정"에 대한 "레보피드 정"의 생물학적 동등성 여부는 식품의약품안전청이 고시한 생물학적 동등성 시험기준2)에 따라 AUCt, Cmax 및 Tmax 등을 평가하였다.
- 아울러, "레보프라이드 정"과 "레보피드 정"에 대하여 대한약전 제 7개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교용출시험을 행하였다. 그리고 본 시험은 식품의 약품안전청으로부터 시험계획서의 승인을 얻은 후 시험계획서에 따라 수행되었으며 모든 피험자의 동의를 받아서 이루어졌다.
- 대하여 통계검정과 분산분석을 행하였다. 또한 대한약전 제 7개정 용출시험법 중 제 2법(패들법)에 따라 비교 용출시험을 행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
성능/효과
- 1. 대조약인 "레보프라이드 정"과 시험약인 "레보피드 정"에 대하여 대한약전 VH에 수재된 제 2법(패들법)에 따라 용출 시험한 결과 pH 1.2, 4.0에서는 10분 이내에 pH 6.8에서는 15분 이내에, 물에서는 90분 이내에 대조약과 시험약 모두 85% 이상의 용출률을 나타내었고, 그 용출양상도 유사하였다.
- 2. 대조약인 "레보프라이드 정"의 평균 AUCt(ng . hr/ml) 는 521.56± 168.31, 시험약인 "레보피드정"은 528.40±156.22로 대조약에 대한 평균치 차가 -1.17%이었고, Cmax(ng/mZ)는 42.22± 16.46과 46.21 ± 20.36으로 1.20%의 차이를 보였으며 Tmax(hr)는 4.38±1.60과 3.69±1.31 로 -1.09% 의 차이를 나타내 대조약게 대한 시험약의 평균치 차이는 대조약의 ±20% 이내 이어야 한다는 생물학적 동등성 평가를 위한 전제 조건을 만족하였다.
- 3. "레보프라이드 정"에 대한 "레보피드 정"의 분산분석 결과, 로그변환한 AUCt 및 Cmax에 대해 유의수준 α=0.05에서 군간 순서효과는 나타나지 않았으며, 90% 신뢰한계는 각각 log(0.93)~log(1.07) 및 log(0.90)~log(1.14)로 나타나 log (0.8)~log( 1.25)이어야 하는 생물학적 동등성 시험기준을 만족하였다. 한편, Tmax(hr)에 대한 90% 신뢰한계(δ, %)는 -19.
- 이상의 시험결과를 종합해 보면 시험약인 "레보피드 정"은 대조약인 "레보프라이드 정"에 대하여 생물학적 동등성 시험의 판단기준인 2항목(AUCt 및 Cmax) 및 참고 값(Tmax)에서 모두 동등한 것으로 나타나 두 제제는 생물학적으로 동등하다고 사료되었다.
- 대조약과 시험약에 대하여 대한약전에 수재된 패들법에 따라 용출시험한 결과를 pH 1.2, 4.0에서는 10분 이내에 pH 6.8에서는 15분 이내에, 물에서는 90분 이내에 대조약과 시험약 모두 85% 이상의 용출률을 나타내었고 두 제제의 용출 양상은 거의 차이가 없었으며, FDA guideline7)에 따라 계산한 물에서의 similarity factor(f2)가 66.04로 나타나 두 제제 간의 용출은 차이가 없는 것으로 판단하였다(Figure 1).
- 로그변환한 평균치 차의 AUCt 및 Cmax에 대한 90% 신뢰 한계는 log(0.93)~log(1.07) 및 log(0.90)~log(1.14)로 나타나 log(0.8)에서 log(1.25)이어야 한다는 생물학적 동등성 시험기준을 만족하였으며, 참고값인 Tmax 평균치 차의 90% 신뢰구간도 -19.47%~16.20%로 ±20% 이내 이어야 한다는 조건을 만족하였다.
- 먼저 유의수준 α가 0.05일 때 Tmax와 로그변환한 AUGt 및 Cmax 값에 대한 F비(Fg)가 F 분석표의 한계값인 F(l, 25) =4.242 보다 모두 작게 나타나 교차시험이 제대로 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
- 0분이었으며 각 물질의 분리상태는 양호하였다. 신호대 잡음비(S/N ratio)를 3으로 하고 일내 및 일간 변동계수의 크기를 20% 이하로 하였을 때의 정량한계 (LOQ, limit of quantitation)는 약 0.25 ng/ml이었으며, 수용액 중 약물을 추출한 것의 평균 피이크 면적에 대한 추출 시료 중 약물의 피이크 면적 비로부터 구한 추출회수율(%)은 85.66±4.60이었다. 혈청 시료로부터 구한 레보설피리드의 검량선은 피이크 면적비(y)= 0.
- 반복 측정하여 얻은 표준편차(% deviation)도 모두 ±15% 이내로 나타났다. 이로부터 혈청 중 레보설피리드에 대한 상기 HPLC 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도와 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
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