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문제 정의
- 분화시킨다.10)본 연구에서는 이러한 3T3-L1 세포의 특성을 이용하여 인슐린성 물질의 존재 가능성을 탐색하였다.
- 본 연구에서는 동의보감의 소갈 처방에서 사용하고 있는 한약재 중에서 인슐린성 물질을 탐색하기 위해 3T3-L1 지방세포 모델을 이용하여 3T3-L1 섬유아세포(Hbroblast)의 증식 및 3T3-L1 지방세포로 분화할 때 미치는 영향을 살펴보았다.
제안 방법
- SRB법에 의한 세포증식능측정은 Alley 등$과 Skehan 등5)의 방법을 응용하여 사용하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM배지에서 3일간 배양하고 배양배지를 제거한 후, PBS로 세포표면을 세척하고 0.25% trypsin-EDTA 1 ml를 첨가하여 1분간 반응 후, 0.25% trypsin-EDIA 를 제거, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 5 ml를 첨가하여 피펫팅하고 세포부유와 1% trypan blue를 1:1로 혼합하여 Haemacytometer로 세포수를 계산하여 5P104 cells/mZ로 부유시켰다. 세포부유액 100씩을 96 well plate의 각 well에 분주하여 well당 5x103 cells/ml의 세포가 접종되게한 다음 CO2 incubator(5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 다시 각 well에 추출한 한약재 시료를 각각 250, 100, 10 그리고 1 ㎍/ml로 희석하여 첨가하였다.
- 인슐린성 물질 탐색. Haemacytometer로 계산된 5x103 cells/ml의 세포를 24 well plate의 각 well에 넣고 PBS로 세척한 후 10% FBS을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 완전히 confluent 상태가 될 때까지 배양하고, 새로운 DMEM7FBS 배지로 갈아주고 추출한 시료를 각각 100, 10 그리고 1㎍/ml로 첨가하여 2일동안 배양한 후(전기배양), 새로운 DMEMeBS 배지로 갈아주고 시료를 각각 100, 10 그리고 1㎍/ml로 재첨가하여 5일간 배양하였다(후기배양). 인슐린과의 관계를 알아보기 위해, 분화유도물질인 dexamethasone 0.
- 통계적 처리. SRB assay와 세포의 분화능에 미치는 검액의 효과는 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 백분율로 환산하여 이항검정 p-value로 처리하였다. 대조군에 대한 pvalue는 0.
- SRB법에 의한 세포증식율 측정. SRB법에 의한 세포증식능측정은 Alley 등$과 Skehan 등5)의 방법을 응용하여 사용하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM배지에서 3일간 배양하고 배양배지를 제거한 후, PBS로 세포표면을 세척하고 0.
- 한약재를 열수 또는 메탄올추출하고동결건조하여 만든 분말 엑스시료를 증류수에 녹여 각각 1, 10 그리고 100㎍/ml로 처리하였다. 대조군은 분화유도물질 (DEX 0.25 μM, MIX 0.5 mM, 인슐린 만을 첨가한 것을 100%로 하였다. 추출 시료들은 분화유도물질들을 첨가하거나 첨가하지 않고 분화정도를 백분율로 환산하여 측정하여, 대조군에 비해 유의성 있게 분화를 촉진시키는 지를 확인하였다.
- 대조군은 분화유도물질이 함유된 DMEM/FBS 배지를 사용하였다. 분화정도의 측정은 OU-Red-O 로 염색하여 측정하였는데,7) PBS로 2회 세척 후, 10% formalin을 50 B씩 첨가(최종농도 3% formaHn)&로 30분간 세포를 고정시키고, 증류수로 3회 반복하여 세척하고, 공기 중에서 건조한 다음 OU-Red-O로 2시간 동안 염색하였다. 염색후증류수로 3회 세척하고, 공기 중에서 건조시키고 isopropyl alcohol 100μl씩 분주하여 1시간 동안 용출시켜 ELISA reader Spectra Max 340(Molecular Devices, USA)로 510nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 25% trypsin-EDIA 를 제거, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 5 ml를 첨가하여 피펫팅하고 세포부유와 1% trypan blue를 1:1로 혼합하여 Haemacytometer로 세포수를 계산하여 5P104 cells/mZ로 부유시켰다. 세포부유액 100씩을 96 well plate의 각 well에 분주하여 well당 5x103 cells/ml의 세포가 접종되게한 다음 CO2 incubator(5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 다시 각 well에 추출한 한약재 시료를 각각 250, 100, 10 그리고 1 ㎍/ml로 희석하여 첨가하였다. CO2 incubator에서 2일간 배양하여 배양이 끝난 세포에 TCA(Trichloroacetic acid, Aldrich)를 최종 농도가 10%로 되게 첨가하고 4℃에서 1시간배양하여 세포를 고정시켰다.
- 분화정도의 측정은 OU-Red-O 로 염색하여 측정하였는데,7) PBS로 2회 세척 후, 10% formalin을 50 B씩 첨가(최종농도 3% formaHn)&로 30분간 세포를 고정시키고, 증류수로 3회 반복하여 세척하고, 공기 중에서 건조한 다음 OU-Red-O로 2시간 동안 염색하였다. 염색후증류수로 3회 세척하고, 공기 중에서 건조시키고 isopropyl alcohol 100μl씩 분주하여 1시간 동안 용출시켜 ELISA reader Spectra Max 340(Molecular Devices, USA)로 510nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Sigma)용액 100 B씩 가하여 상온에서 30분동안 충분히 염색시킨 후 1% acetic acid로 5 회 세척하여 공기중에서 건조시켰다. 완전히 건조되면 10mM unbuffered Tris(pH 10.5) 용액을 각 well에 첨가하여 세포단백질에 부착된 SRB 염료를 10분간 잘 용출시키고 균일하게 만든 후 ELISA reader(Spectra340, Molecular Devices) 564 nm에서 흡광도(OD)를 측정하여 세포의 증식 정도를 측정하였다.
- Haemacytometer로 계산된 5x103 cells/ml의 세포를 24 well plate의 각 well에 넣고 PBS로 세척한 후 10% FBS을 함유하고 있는 DMEM 배지에서 완전히 confluent 상태가 될 때까지 배양하고, 새로운 DMEM7FBS 배지로 갈아주고 추출한 시료를 각각 100, 10 그리고 1㎍/ml로 첨가하여 2일동안 배양한 후(전기배양), 새로운 DMEMeBS 배지로 갈아주고 시료를 각각 100, 10 그리고 1㎍/ml로 재첨가하여 5일간 배양하였다(후기배양). 인슐린과의 관계를 알아보기 위해, 분화유도물질인 dexamethasone 0.25 μM(DEX, Aldrich), 1 -methyl-3-isobutyl-xanthine 0.5 mM(MIX, Aldrich)과 insulin(10 ㎍/m/, Sigma)이 함유된 DMENKFBS 배지에 증류수로 녹인 시료를 각각 100, 10 그리고 1 ㎍/ml로 첨가하여 전기배양과 후기배양을 하였다. 대조군은 분화유도물질이 함유된 DMEM/FBS 배지를 사용하였다.
- 5 mM, 인슐린 만을 첨가한 것을 100%로 하였다. 추출 시료들은 분화유도물질들을 첨가하거나 첨가하지 않고 분화정도를 백분율로 환산하여 측정하여, 대조군에 비해 유의성 있게 분화를 촉진시키는 지를 확인하였다.
- 물질 탐색. 한약재를 열수 또는 메탄올추출하고동결건조하여 만든 분말 엑스시료를 증류수에 녹여 각각 1, 10 그리고 100㎍/ml로 처리하였다. 대조군은 분화유도물질 (DEX 0.
대상 데이터
- 5 mM(MIX, Aldrich)과 insulin(10 ㎍/m/, Sigma)이 함유된 DMENKFBS 배지에 증류수로 녹인 시료를 각각 100, 10 그리고 1 ㎍/ml로 첨가하여 전기배양과 후기배양을 하였다. 대조군은 분화유도물질이 함유된 DMEM/FBS 배지를 사용하였다. 분화정도의 측정은 OU-Red-O 로 염색하여 측정하였는데,7) PBS로 2회 세척 후, 10% formalin을 50 B씩 첨가(최종농도 3% formaHn)&로 30분간 세포를 고정시키고, 증류수로 3회 반복하여 세척하고, 공기 중에서 건조한 다음 OU-Red-O로 2시간 동안 염색하였다.
- 한약재료. 본 실험에 사용한 한약재는 서울 경동시장에서 구입하여 한국한의학연구원에서 보관하고 있는 표본과 비교하여 선정한 후, 본 연구의 저자인 우석대학교 본초학교실의 주영승교수가 감정한 것을 사용하였고, 일련 번호를 붙이고 한국한의학연구원 표본실에 보관하고 있다.
- 및 배지. 실험에 사용한 3T3-L1 세포는 한국세포주은행에서 구입하였고 1% fetal bovine serum(FBS), gentamycine(100 units/ml), streptomycin(100 ㎍/ml) 등을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 3T3-L1 섬유아세포는 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(PBS, Sigma) 용액으로 씻어준 후 50 ml flask당 ImZ의 0.
이론/모형
- SRB법에 의한 세포증식율 측정. SRB법에 의한 세포증식능측정은 Alley 등$과 Skehan 등5)의 방법을 응용하여 사용하였다.
성능/효과
- 3T3-L1 섬유아세포를 계대배양과 동일한 방법으로 완전히 채워질(confluent 상태) 때까지 배양하여 DMEM/FBS배지로 새로 바꾸고 한약재 추출 시료를 넣어 2일 동안 전기배양한 후, 다시 한약재 추출 시료가 함유되어 있는 새로운 DMEM/FBS배지로 교체하여 후기배양한 결과, 과루인과 대황은 100, 10 그리고 1 ㎍/ml에서 각각 p<0.01과 p<0.05로 분화를 촉진하였다 (Table 2). 현삼과 고삼은 100㎍/m;에서 각각 118.
- SRB법에 의한 세포증식율 측정. 3T3-L1 세포가 지방세포로분화되기 전단계인 전지방세포의 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과(Table 1), 3T3-L1 세포의 생존율은 반하는 250, 100, 10 그리고 1㎍/mZ에서 p<0.01 로 억제하였고, 후박은 250과 100㎍/mZ에서 p<0.01 로 생존율을 억제하였다. 대황은 100와 250㎍/mZ에서 각각 p<0.
- 계대배양. 3T3-L1은 DMEM/FBS 배지로 통상적인 조건인 371의 5% CO2 항온기에서 배양되면 doubHng time이 20~30 시간 걸린다고 알려지고 있으며, 본 실험에 사용한 3T3-L1 섬유아세포의 표준증식을 조사한 결과 doubling timee 16.7시간이었으며 포화밀도 (saturation density)는 5x 104 cells/㎠로 측정되어, 3T3-L1 섬유아세포의 일반적인 증식특성을 보유하고 있는 것으로 확인되었다. 섬유아세포(preadipocyte)인 3T3-L1 세포는 생물학적 특성이 잘 밝혀져 있고, 적절한 조건하에서 배양하면 지방세포로 분화하는 성질을 갖고 있어 지방세포의 대사과정에 있어 지방분해 억제 혹은 합성 연구에 사용하고 있다.
- 섬유아세포는 인슐린과 같은 유도물질의 존재 하에서는 효소 활성을 급격히 증가시켜 분화를 촉진하는 특성을 가지고 있어 동·식물 중의 인슐린성 물질의 존재 여부를 탐색하는데 용이하다.9)3T3-L1 세포는 계대배양 횟수에 따라 변화가 있을 수 있는 것으로 알려져 있는데, 계대배양이 10회 이상이 되면 다소 활성이 떨어지는 경향이 있었다.
- 본 연구결과를 종합해보면, 마황, 과루인, 현삼과 고삼은 유도물질이 첨가되지 않았을 때 혹은 첨가되어 있더라도 검액이 3T3-L1 전지방세포의 분화를 촉진시켰으며 , 이는 인슐린성 물질이 함유되어 있을 가능성이 높음을 시사하고 있다.
- 05로 분화를 촉진하였다. 오가피, 노회, 백모근, 노근 그리고 저령은 100㎍/ml에서 p<0.01 로 분화를 억제하였다. 또한, 마황은 100㎍/ml에서 86.
- 대황과 후박은 분화유도물질이 없이 추출물만 첨가한 농도에 따라 세포의 분화를 촉진시켰고, 분화유도물질을 첨가하면 추출물의 각 농도에서 세포의 분화에 아무런 영향을 주지 않았다. 창출, 마황과 보두는 분화유도물질이 없는 경우 고농도인 100㎍/ml에서 3T3-L1 세포 분화를억제하고 있지만 저농도인 10 혹은 1 ㎍/ml에서는 세포의 분화를 촉진하였고, 분화유도 물질을 첨가하면 창출과 보두는 세포분화에 아무런 영향을 주지 않지만 마황의 경우는 100㎍/ml에서 세포 분화를 억제하는 흥미로운 결과를 얻을 수 있었다. 마황 중에 함유되어 있는 ephedrinee catecholamine의 분비를 촉진하여 지방분해를 일으킨다고 알려지고 있는데, Takaku 등11)은 마황 중에 함유되어 있는 norpseudoephedrine이 지방합성을 촉진하며 norephedrinee 저농도에서는 지방분해를 촉진하고 고농도에서는 지방분해를 억제하는 작용이 있음을 확인하였고, Konno 등12)은 마황 열수 추출물에 혈당저하작용이 있음을 보고하였다.
- 01 로 생존율을 억제하였다. 한약재 추출 시료의 농도가 250㎍/m/에서 오가피는 p<0.01, 창출과 보두는 p<0.05로 생존율을 억제 하였다. 그러나, 마황은 250㎍/ml에서 p<0.
- 한약재 추출물들이 3T3-L1 섬유아세포의 증식율에 미치는 영향을 보면 반하, 후박, 대황, 오가피, 창출과 보두에서는 억제되었는데, 마황은 250㎍/ml에서 증가를 촉진하였다. 특히, 반하는 250, 100, 10 그리고 1㎍/ml에서 p<0.
후속연구
- 마황 중에 함유되어 있는 ephedrinee catecholamine의 분비를 촉진하여 지방분해를 일으킨다고 알려지고 있는데, Takaku 등11)은 마황 중에 함유되어 있는 norpseudoephedrine이 지방합성을 촉진하며 norephedrinee 저농도에서는 지방분해를 촉진하고 고농도에서는 지방분해를 억제하는 작용이 있음을 확인하였고, Konno 등12)은 마황 열수 추출물에 혈당저하작용이 있음을 보고하였다. 이 결과들에서 3T3-L1 섬유아세포의 분화과정은 검액과 유도물질 사이의 상호작용으로 일정 농도이상에서는 세포분화를 억제하고 있고 세포막의 인슐린 수용체가 증가되는 과정에서 검액과 유도물질 사이에 농도 의존적으로 영향을 주고있다고 추측되며 추후 더 연구 검토되어야 할 것이다.
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