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문제 정의
- 따라서 본 연구는 천마의 효능중 그동안 연구보고가 상대적으로 미흡했던 생리효능을 섬토하고, 이를 토대로 기능성 식품의 개발이나 관련 연구의 기초자료로서 활용하고자 천마추출물의 성문을 분석하였고, 암세포에 대한 생육 처해 능을 비롯한 항균력, 당분해 효소(a-glucosidase) 활성 저해능, angiotensin converting enzyme(ACE)저해능및 glutathion S-transferase(GST) 활성을 검토하였다.
- 본 연구는 천마의 성분과 생리활성을 규명하기 위하여 성분분석과 다양한 생리활성(암세포 생육 저해효능, 항균력, α-이ucosidase활성 저해효능, angiotensin converting enzyme 저해효능, glutathion S-transferase 활성)을 검토하였다. 천마의 일반성분은 조단백질 5.
제안 방법
- 간암세포 76% 및 폐암세포 72%로 가장 높게 나타났다. 또 자료로는 나타내지 않았으나 천마의 세포독섬을 0.2-1.0 mg/ml 범위에서 검토한 결과, 정상 간세포인 WRL 68에 대하여 0.2 mg/m;일 때 7%, 0.6 mg/ml서 9%, 1.0 mg/ml"의 농도에서 10%의 저해능을 보여 천마추출물은 0.2시.0mg/ml의 농도범위에서 세포독성이 거의 없는 것으로 판단되어 이 농도범위에서 암세-푸 성장 저해 효능을 검토하였다. 황등(1996)이 주목의 에탄올추출물이 인간의 간암세포에 대한 생육 저해능을 검토한 결과에서 0.
- 4%(w/v) SRB용액을 100μ 첩가하고 상온에서 30분 동안 염색시겼다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% 의 acetic acid로 세척하여 건조하고 lOmM의 Tris buffer 용액 100ul들 첨가하여 염색액을 녹인 다음, 540 nm에서 microplate rcadei를 이용하여 홉광도를 즉정하여 천마 추출물의 암세포 및 정상세포에 대한 생육저해능을 검토하였다.
- 그 후반응액에 1 μl의 dinitrosalicylic acid(DNS) 시약을 첨가하고 100℃의 water bath에서 약 10 min 동안 반응시 킨후에 냉각한 다음, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후 효소 반응으로 생성된 환원당의 정 량은 표준 검정직선으로부터 구하여 효소활성 저해율을 계산하였다.
- 효소를 10 mM PIPES buffer에 용해시켜 효소액을 제조하고, 이 효소용액 10μl에 20mM의 maltose기질용맥 40μl를 혼합한 다음, 각 시료용액 10 μl를 가하여 혼합하고 37℃의 water bath에서 20분간 반흥시켰다. 그 후반응액에 1 μl의 dinitrosalicylic acid(DNS) 시약을 첨가하고 100℃의 water bath에서 약 10 min 동안 반응시 킨후에 냉각한 다음, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 후 효소 반응으로 생성된 환원당의 정 량은 표준 검정직선으로부터 구하여 효소활성 저해율을 계산하였다.
- 실험 전에 모든 반응물을 37℃로 유지시켜 놓은 후 37℃ 증류수 10μl에 ACE reagent를(one vial) 용해시키고 1 ml씩 취하여 effendorf tube에 분주하였다, 그 후 시료와 ACE calibrator를 100μ씩 첨가한 후 37”C에서 5분간 반응시켜 340nm에서 흡광도를 측정하여 초기값으로 하였으며, 다시 5분이 지난 후 측정한 흡광도를 최종 흡광도값으로 하였다. 대조 구는 시료 대신 증류수 100μ를 첨가한 것으로 하였으며, 다음과 같이 ACE의 활성을 산출하였다.
- 조제된 반응 시약에 각 시료를 첨가하여 37℃게서 5분간 반응시킨 다음, 기질로서 1 -chloro-2, 4-dinitrobenzenee- 첨가한 후 다시 37℃에서 2뿐간 반응시켰다. 반응후 20%의 TCA를가하여 반응을 종결시키고 원심분리한 다음 상등액을 340nm에서 흡광도를 측정한 뒤 대조구와 비교하여 단백질 함량에 따른 specific activity와 활성율을 계산하였다. 이때 시료의 단백질함량은 knvry법(Bollag and Edelstein, 1991)으로 측정하였다.
- 법(1980)에 따라 수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 조섬유를 각각 다음과 같이 정량하였다. 수분은 수분즉정기를 이용하여 lOfC에서 건조에 외한중량 감소율을 백분율로 표시하여 구하였으며. 조단백질함량은 Kjeldahl 분해장치로 분해한 다음-, 질소 자동분석 7] (Auto sampler system, 1035 analyzer, Sweden)로 질소함량을 구한 후 단백질계수를 곱하여 환산하였다.
- 수분은 수분즉정기를 이용하여 lOfC에서 건조에 외한중량 감소율을 백분율로 표시하여 구하였으며. 조단백질함량은 Kjeldahl 분해장치로 분해한 다음-, 질소 자동분석 7] (Auto sampler system, 1035 analyzer, Sweden)로 질소함량을 구한 후 단백질계수를 곱하여 환산하였다. 조지방은 시료를 원통 여지에 넣고 Soxhlet 추출기 내에서 15-18시간 ethej■로 추출한 후 추춭물을 긴조하여 평량하였으며, 조회분은 시료 10~20g을 도가니에 평취하여 550-600℃의 회화로에서 5~10시간 회화시켜 정량하였다.
- 조지방은 시료를 원통 여지에 넣고 Soxhlet 추출기 내에서 15-18시간 ethej■로 추출한 후 추춭물을 긴조하여 평량하였으며, 조회분은 시료 10~20g을 도가니에 평취하여 550-600℃의 회화로에서 5~10시간 회화시켜 정량하였다. 조섬유는 Fibertec system(Sweden)으로 측정하였고, 전당함량은 상기에서 분석한 일반성분의 총합을 100에서 감하여 계산하였다. 한편, 미네랄 성분은 시료를 H2SO4, HC1O4, 및 HQ 분해액으로 분해한 다음 여과하여 ICPflnductivity Coupled Plasma, Victoria 3175, Austrailia)로 분석하였다.
- 조단백질함량은 Kjeldahl 분해장치로 분해한 다음-, 질소 자동분석 7] (Auto sampler system, 1035 analyzer, Sweden)로 질소함량을 구한 후 단백질계수를 곱하여 환산하였다. 조지방은 시료를 원통 여지에 넣고 Soxhlet 추출기 내에서 15-18시간 ethej■로 추출한 후 추춭물을 긴조하여 평량하였으며, 조회분은 시료 10~20g을 도가니에 평취하여 550-600℃의 회화로에서 5~10시간 회화시켜 정량하였다. 조섬유는 Fibertec system(Sweden)으로 측정하였고, 전당함량은 상기에서 분석한 일반성분의 총합을 100에서 감하여 계산하였다.
- 그 후무간상 내에서 배지와 피검균 배양액 0, 1 ml를 혼합하여 멸균된 petri-di나!에 주입하고 2~3시간 방치하여 평판배지를 만들고 난 다음-, 멸균된 직경 8 mm의 filter paper disc 를 평판배지에 올려놓았다. 천마 추출물 시료를 5 mg/disc 농도가 되도록 주입한 후 35℃의 incubatoi에서 24~48시간 동안 배양하며서 disc주번의 clear zone(mm)을 측정하여 항균력을 조사하였다. 이때 사용한 피검균은 총 6종으토 gram positive bacteria 3종(Listeria monocytogenes ATCC 19111, Bacillus subtilis KCCM 11204 및 Sthaphylococcus aureus KCCM 32395)과 gram negative bacteria 3종(Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli O157:H7932 및 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) 을 각칵 사용하였다.
- 조섬유는 Fibertec system(Sweden)으로 측정하였고, 전당함량은 상기에서 분석한 일반성분의 총합을 100에서 감하여 계산하였다. 한편, 미네랄 성분은 시료를 H2SO4, HC1O4, 및 HQ 분해액으로 분해한 다음 여과하여 ICPflnductivity Coupled Plasma, Victoria 3175, Austrailia)로 분석하였다.
대상 데이터
- MCC로부터 분양받아 사용하였다. 또 시료의 세포독성을 알아보기 위하여 사람의 정상 간세포 WRL 68을 실험에 사용하였다, WRL 68, Hep3Bs MCF7, AGS 는 DMEM(Delbecco, s modified eagle medium)올 사용하였고, A549는 RPMI 1640 배지에서 10% fetal bovine serum(FBS)으로적응시켜 배양하였다. SRB assay는 실험 대상 세포를 4-5X 104 cell/mm 농도로 96well plate의 각 well에 100μ씩 첨가하여 24시간 동안 배양(37℃, 5% COJ한 후, 각 시료 100ㅕㅣ씩 첨가하여 48시간 배양하있다.
- 본 실험에 사용된 천마는 강원노 춘천 남면소재의 (주) 천마산업으로부터 제공받은 것-으로 4℃의 저장고에 보丑 하면서 사용하였다. 천마로부티 유용싱분의 추출은 건조된 천마분말에 중량비루 10배 (w/v) 용량의 물을 가하고, 온도 90~95℃에서 8시간 농안 환류추출한 다음, 원심분리하여 상둥액을 회수하였으며, 상등액은 다시 농축한 다음 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
- 암 세포주는 인간의 간암세표인 Hep3B(hepatocellular carcinoma, human), 폐암세포인 A549(]ung carcinoma, human), 유방암세포인 MCF7(brest adenocarcinoma, pleural effusion, human) 및 위암세포인 AGS(gastric carcinoma, human)을 MCC로부터 분양받아 사용하였다. 또 시료의 세포독성을 알아보기 위하여 사람의 정상 간세포 WRL 68을 실험에 사용하였다, WRL 68, Hep3Bs MCF7, AGS 는 DMEM(Delbecco, s modified eagle medium)올 사용하였고, A549는 RPMI 1640 배지에서 10% fetal bovine serum(FBS)으로적응시켜 배양하였다.
- 천마 추출물 시료를 5 mg/disc 농도가 되도록 주입한 후 35℃의 incubatoi에서 24~48시간 동안 배양하며서 disc주번의 clear zone(mm)을 측정하여 항균력을 조사하였다. 이때 사용한 피검균은 총 6종으토 gram positive bacteria 3종(Listeria monocytogenes ATCC 19111, Bacillus subtilis KCCM 11204 및 Sthaphylococcus aureus KCCM 32395)과 gram negative bacteria 3종(Salmonella typhimurium ATCC 14028, Escherichia coli O157:H7932 및 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) 을 각칵 사용하였다.
- 사용하였다. 천마로부티 유용싱분의 추출은 건조된 천마분말에 중량비루 10배 (w/v) 용량의 물을 가하고, 온도 90~95℃에서 8시간 농안 환류추출한 다음, 원심분리하여 상둥액을 회수하였으며, 상등액은 다시 농축한 다음 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 생물활성실험은 3반복 실험을 행하고 얻은 자료는 평균값과 표준편차를 구하였으며, 각 평균값 사이의 유의성은 Duncan의 multiple range test로 p < 0.05 수준에서 검 정하였다.
이론/모형
- 각종 암세포에 대한 생육 저해활성의 검정은 SRB(sul-forhodamine B) assay(Skehan et al., 1990)에 의하여 다음과 같이 수행하였다.
- 고혈압을 일으키는 angiotensin converting enzyme(ACE) 의 효소 활성 저해능은 Maguire와 Price(1985)의 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다. 실험 전에 모든 반응물을 37℃로 유지시켜 놓은 후 37℃ 증류수 10μl에 ACE reagent를(one vial) 용해시키고 1 ml씩 취하여 effendorf tube에 분주하였다, 그 후 시료와 ACE calibrator를 100μ씩 첨가한 후 37”C에서 5분간 반응시켜 340nm에서 흡광도를 측정하여 초기값으로 하였으며, 다시 5분이 지난 후 측정한 흡광도를 최종 흡광도값으로 하였다.
- 반응후 20%의 TCA를가하여 반응을 종결시키고 원심분리한 다음 상등액을 340nm에서 흡광도를 측정한 뒤 대조구와 비교하여 단백질 함량에 따른 specific activity와 활성율을 계산하였다. 이때 시료의 단백질함량은 knvry법(Bollag and Edelstein, 1991)으로 측정하였다.
- 일반성분은 A.O.A.C.법(1980)에 따라 수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 조섬유를 각각 다음과 같이 정량하였다. 수분은 수분즉정기를 이용하여 lOfC에서 건조에 외한중량 감소율을 백분율로 표시하여 구하였으며.
- 천마의 gultathion S-transferase(GST)의 활성은 Benson 둥(1979)의 방법으로 다음과 같이 측정하였다. 조제된 반응 시약에 각 시료를 첨가하여 37℃게서 5분간 반응시킨 다음, 기질로서 1 -chloro-2, 4-dinitrobenzenee- 첨가한 후 다시 37℃에서 2뿐간 반응시켰다.
- 추출물의 항균력은 paper disc를 이용한 agar diffusion method(Zaika, 1988)를 사용하여 다음과 같이 측정하였다.TSA(tryptic soy agar) 배지를 조제하여 시험관에 20 분주하고 12℃에서 15분간 살균한 다음, 45~50℃의 항온수조에 넣어 배지를 일정한 온도로 유지하였다.
성능/효과
- 0mg/ml 때 64%의 높은 저해능을 보였다. ACE 활성 저하능은 시료가의 농도 범위에서 63~89%이었고, LOmg/꺼/일 때 89%로 높은 저해능을 보였다. Glutathion S-transferase(GST) 활성 능은 추출물 농도가 LOmg/mZ일때 221%의 높은 활성을 나타내었다, 이상의 결과로부터 천마는 건강식품이나 기능성 식품의 소재로서 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
- ACE 활성 저하능은 시료가의 농도 범위에서 63~89%이었고, LOmg/꺼/일 때 89%로 높은 저해능을 보였다. Glutathion S-transferase(GST) 활성 능은 추출물 농도가 LOmg/mZ일때 221%의 높은 활성을 나타내었다, 이상의 결과로부터 천마는 건강식품이나 기능성 식품의 소재로서 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 2 mg/nu에서 l.Omg/ml 농도가 증가함에 따라 암세포에 대한 저해능도 모두 유의적으로 중가하여 1.0mg/ml에서 위 암세포에대한 생육 저해능은 83%, 유방암세포 79%. 간암세포 76% 및 폐암세포 72%로 가장 높게 나타났다.
- 천마추출물의 항균활성은 Bacillus subtiliss Pseudomonas aeruginosa에 대하여 미약한 활성을 나타내었으며, 그 이외의 피검균에 대하여는 항균활성이 거의 없었다.αa-glucosidase효소 활성 저해능은 천마추출물 시료가 1.0mg/ml 때 64%의 높은 저해능을 보였다. ACE 활성 저하능은 시료가의 농도 범위에서 63~89%이었고, LOmg/꺼/일 때 89%로 높은 저해능을 보였다.
- Omg/ml일 때 89%로 매우 높은 효소활성 저해능을 나타내었다. 또 농도에 따른유의성 검색 결과, 저농도인 0.2 mg/ml의 저해능과 0.6 mg/ml 및 0.8mg/ml에서의 저해능 사이에는 유의성이 있었으나 두 고농도 사이에는 유의성이 없었다.
- 같다.일반성분중에서 조단백질의 함량이 5.4%, 조회분 2.6%, 조지방 3.6%, 조섬유 3.3%, 수분 8.1%이었으며, 전당이 77%로 가장 높았다’ 한편, 무기질함량은 칼륨이 1, 150 mg/100g로 가장 많았으며, 인함량도 300mg/100g로 비교적 많이 함유되어 있었다.
- 천마의 일반성분은 조단백질 5.4%, 조회분 2.6%, 조지방 3.6%, 조섬유 3.3%, 수분 8.1%, 전당이 77% 이었으며, 무기질함량은 칼륨(1, 150 mg/100g>인(300mg / 100 g) 순이었다, 천마추출물의 암세포(간암; Hep3B, 유방암; MCF-7, 폐암; A549, 위암; AGS)에 대한 생육 처해능은 천마추출물 시료농도가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보여 1.0 mg/μl에서 위얌세포(AGS)에 대한 생육 저해능이 83%로 가장 높았다. 천마추출물의 항균활성은 Bacillus subtiliss Pseudomonas aeruginosa에 대하여 미약한 활성을 나타내었으며, 그 이외의 피검균에 대하여는 항균활성이 거의 없었다.
- 천마추출물의 농도가 0.2 때 175%의 활성 능을 보였으며 , 일 경우에는 221%의 높은 활성을 나타내었고 또 각 농도에서 GST 활성은 모두 유의성이 있었다.
- 0 mg/μl에서 위얌세포(AGS)에 대한 생육 저해능이 83%로 가장 높았다. 천마추출물의 항균활성은 Bacillus subtiliss Pseudomonas aeruginosa에 대하여 미약한 활성을 나타내었으며, 그 이외의 피검균에 대하여는 항균활성이 거의 없었다.αa-glucosidase효소 활성 저해능은 천마추출물 시료가 1.
후속연구
- 천마의 당분해효소 저해능은 추출물내에 존재하는 특정 성분에 의해 기질인 maltose를 분해히는 ct-glucosidase의활성을 저해하는 저해제(inhibitor)로 작용하거나 효소를흡착하여 정상적인 효소의 작용을 저해하기 때문인 것으로 생각되었다. 따라서 앞으로 천미추출물을 이용하여 in vivo test에 의한 혈당강하능의 검토 필요성이 있는 것으로 생각도었다.
- :고러므로 혈압 강하를 위해서는 ACE의 작용을 억제하는 저해제를 개발하는 것도 한가지 방안으로 생각할 수 있는데, Hara 등(1987)은 녹차와 흥차에 catechin 및 theaflavin류가 강한 ACE 저해능을 보였다고 보고한 바 있다. 따라서 천마 추출물에는 ACE의 작용을 저해하는 저해제가 함유되어 ACE 활성을저해하는 효능이 큰 것으로 예측되며, 차후 in vivo test 등을 통한 정밀한 검토가 필요한 것으로 생각되었다.
- 이상의 결과로부터 앞으로 천마의 유용성분의 추출 - 분리에 대한 최적조건을 탐색하고, 분리된 각 분획에 대한생리활성(혈당강하, 혈압강하, 간기능 해독)을 in vitro 및 in vivo 실험을 통하여 면밀하게 검토해야 할 필요성이 있는 것으로 판단되었다.
- 5 μg/ml의 시료농도에서 잎의 경우 72%, 수피는 87%, 그리고 뿌리에서 90% 로 가장 높았음을 보고한 바 있는데, 본 실험의 결과는 이에 비해 저해율이 낮았으나 추출용매와 방법 등에서 차이가 있었으므로 차후 천마추출물의 암세포에 대한 효능을 정밀검색 할 경우. 추출용매나 추출조건 등을 다각적으로 검토하여야 할 것으로 생각되었다.
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