[논문]발효 천마 추출물의 생리 활성

박안나; 구태규; 김경선; 이동원; 김상진

doi:10.12925/jkocs.2015.32.4.702

발효 천마 추출물의 생리 활성
Physiological Activities of Fermented Gastrodia elata Blume Extracts 원문보기

한국유화학회지 = Journal of oil & applied science, v.32 no.4, 2015년, pp.702 - 711

박안나 (에코바이오의학연구소) , 구태규 (에코바이오의학연구소) , 김경선 (에코바이오의학연구소) , 이동원 (전북대학교 고분자 나노공학과) , 김상진 (대전보건대학교 화장품과학과)

초록
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천마를 다양한 용매(물, 에탄올 및 70%) 및 다양한 농도 (0.725, 1.25, 2.5 및 5 mg/mL)로 추출하고 추출된 물질을 젖산균과 유용미생물(Effective Microorganisms)로 발효시킨 다음, 이들 물질들이 화장품 소재로 활용 가능한가를 확인하였다. 물, 에탄올 및 70% 에탄올로 추출한 물질들을 각각 0.725, 1.25, 2.5 및 5 mg/mL 농도에서 실험한 결과, flavonoid, polyphenol 및 DPPH free radical scavenger 등과 같은 항산화물질은 에탄올 추출물에 가장 많이 함유되어 있었고, DPPH radical 소거능은 유용미생물로 발효시킨 천마를 에탄올로 추출한 경우 1.25 mg/mL에서 $27.08{\pm}0.5%$이었으나 2.5 mg/mL에서는 $27.08{\pm}0.5%$로 증가하였다. 미백 활성을 측정할 수 있는 tyrosinase 활성 저해 실험에서는 EtOH 추출물을 젖산균으로 발효시켰을 때 가장 저해 효과가 우수하였고(0.725 mg/mL에서 $39.1{\pm}0.4%$, 2.5 mg/mL에서 $62.8{\pm}1.5%$), RAW 264.7 Cells을 이용한 세포 생존율 실험 결과 물, EtOH, 70% EtOH 추출물과 이들의 발효 물질 모두 85%이상의 세포 생존율을 나타내 세포의 염증에 대한 안정성을 확인하였다. ROS 생성으로 인한 항산화 실험에서는 양성 대조군으로 RAW 264.7 cells을 lipopolysaccharide로 자극시켜 활성화된 세포에 비발효와 발효에 따른 추출물을 농도별로 처리하였을 때 유효미생물로 발효시켰을 경우가 가장 항산화성이 높은 것으로 확인하였다. 이상과 같은 연구결과 천마 추출 및 발효 물질은 화장품용 항산화제, tyrosinase 활성 저해제 및 항염증제로 사용될 수 있음을 알았다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to determine the feasibility of using Gastrodia elata Blume as a cosmetic raw material by investigating the physiological activities of its extracts, varying the concentration, solvent, and fermentation method (non-fermentation and fermentation using lactic acid bacteria and effective microorganisms). Of the extracts in three different solvents-water, EtOH, and 70% EtOH-at four different concentrations (0.725, 1.25, 2.5, and 5 mg/mL), the EtOH extracts demonstrated the highest contents of antioxidants (flavonoids, polyphenols, and DPPH free radical scavengers). The DPPH free radical scavenging activity in the EtOH extracts of EM-fermented Gastrodia elata Blume increased from $27.08{\pm}0.5%$ at 1.25 mg/mL to $35.89{\pm}0.8%$ at 2.5 mg/mL. The tyrosinase inhibitory activity test was performed to measure skin-whitening capacity and revealed the LB-fermented EtOH extracts to be the most efficacious ($39.1{\pm}0.4%$ at 0.725 mg/mL, $62.8{\pm}1.5%$ at 2.5 mg/mL). Viability was found to exceed 85% in RAW 264.7 cells treated with all extracts (water, EtOH, 70% EtOH at 10, 25, $50{\mu}L$, fermented and non-fermented), thus proving that Gastrodia elata Blume extracts do not cause inflammation. When RAW 264.7 cells were stimulated with lipopolysaccharide as positive controls under the same conditions to determine the antioxidant activity in the presence of reactive oxygen species (ROS), EM-fermentation was found to impart excellent antioxidant capacity. This study verified the physiological activities of fermented Gastrodia elata Blume extracts that are best suited for cosmetic ingredients, such as antioxidants, tyrosinase inhibitors and anti-inflammatory agents.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Kang 등은 꾸지뽕을 발효시키기 전보다 발 효 시킨 후에 페놀 함량이 증가하였다고 하였으며[11], Jeon 등은 인삼열매를 유산균으로 발효시켰더니 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다고 보고하였고[12], Park 등은 당을 첨가하여 발효 시켰을 때가 발효 시키지 않았을 때 보다 총 페놀의 함량이 증가하였고, 효모균으로 발효시켰을 때 HBA의 함량이 더 증가하였으며 이로 인해 DPPH 라디칼 소거능과 superoxide 소거능이 증가하였다고 보고하면서, 발효 중 protease, amylase, lipase 등의 효소가 페놀성 물질들을 증가하는데 기인한 것으로 판단된다고 하였다[10]. 하지만 이들은 화장품으로써의 적용 가능성을 검토하지 않았던 바 본 연구에서는 발효시킨 천마 추출물의 생리 활성에 대한 연구를 보완하고 화장품 소재로서의 가능성을 검토하기 위하여 천마를 물과 에탄올 등으로 추출하고, 추출된 물질을 유산균과 EM으로 발효 시킨 후 추출 및 발효 물질에 대한 플라보노이드와 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거능, tyrosinase 활성 저해력, 세포 생존율, ROS 생성 등을 확인하여 화장품 소재로써의 활용 가치를 규명하고자 한다.

제안 방법

5 μM DCFH-DA (2′ ,7′ -dichlorofluorescein-diacetate)를 첨가한 후 37℃에서 20분 동안 incubation 시키고 trypsinization와 PBS를 통하여 세포를 얻어 FACS Calibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 측정하였다.
ROS 생성 및 소거능을 확인하기 위하여 RAW 264.7 Cells에서 세포 생존율에 따른 물 추출물과 70% EtOH 추출물에서 배양된 대식세포에서 ROS 생성 정도를 측정하였다. ROS 소거능으로 천마의 추출물을 확인하기 위하여 음성 대조군으로는 RAW 264.
Reactive Oxygen Species (ROS)의 생성을 확인하기 위하여 형광물질인 Dichlorofluorescein (DCF)를 이용하여 측정하였다. RAW 264.
Tyrosinase 저해활성은 Choi와 Oh 등의 실험 방법[16]을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. in vitro 상에서 mushroom tyrosinase 활성 저해 능력을 측정하기 위하여 2.
추출시료 100 μL와 2% Na₂CO₃ 1 mL를 혼합한 후 상온에서 2분 동안 반응 시키고 다시 50% Folin-Ciocalteu's phenol reagent 100 μL를 첨가하여 30 분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 UV/Vis Spectrophotometer (Mecasys co.,)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다.
com)에서 구입하여 사용하였다. 용매별로 추출한 추출물을 발효시키기 위해 EM 활성액은 6%, 설탕은 5%로 하였으며 37℃ 인큐베이터에서 7일간 발효시켜 실험에 사용하였다.
7 (Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line) cells를 96 well plate에 3×10⁵ cells/well의 농도로 파종하고 상기의 배양액으로 각 지지체당 3개씩 정적 배양하였다. 음성 대조군으로는 RAW 264.7 cells 세포만을 배양하였으며, 양성 대조군으로는 RAW 264.7 cells 세포와 염증 유발 물질인 Lipopolysaccharides (LPS)를 첨가하여 12시간 동안 배양하였다. 5 μM DCFH-DA (2′ ,7′ -dichlorofluorescein-diacetate)를 첨가한 후 37℃에서 20분 동안 incubation 시키고 trypsinization와 PBS를 통하여 세포를 얻어 FACS Calibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 측정하였다.
천마를 용매로 추출하기 전과 후 및 추출된 물질을 발효시키기 전과 발효 시킨 후의 DPPH radical 소거능 차이를 비교 실험하였다. 이때 추출물의 농도는 농도별 경향을 파악하기 위해 0.725, 1.25, 2.5, 5 mg/mL의 농도로 고정해 놓고 실험하였다. 실험 결과 전자 공여능(EDA %: Electron Donating Ability)으로 표시된 DPPH radical 소거능은 농도가 증가할수록 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 추출용매별로 보면 EtOH > 70% EtOH > Water 순이었고, 발효여부에 따라서는 EM 발효 > 유산균 발효 > 비발효 순으로 나타났다.
천마 추출물을 젖산균으로 발효시키기 위하여 시험관에 증류수 10 mL과 천마 추출물 10 mg 및 젖산균 0.1 mL의 비율로 넣고 잘 섞은 다음 37℃ 인큐베이터에서 2일간 발효시켜 실험에 사용하였다.
천마 추출물의 항산화력은 Choi 등의 실험 방법[15]을 변형시킨 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 능력으로 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능 측정 방법은 항산화 물질의 전자 공여능을 측정하는 방법으로 천연물에서 많이 사용되어지는 실험방법이다.
천마를 용매로 추출하기 전과 후 및 추출된 물질을 발효시키기 전과 발효 시킨 후의 DPPH radical 소거능 차이를 비교 실험하였다. 이때 추출물의 농도는 농도별 경향을 파악하기 위해 0.
천마를 용매로 추출하기 전과 후 및 추출된 물질을 발효시키기 전과 발효 시킨 후의 tyrosinase 저해 활성을 비교 실험하였다. 이때 추출물의 농도는 농도별 경향을 파악하기 위해 0.

대상 데이터

RAW 264.7 (Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line) cells를 96 well plate에 3×105 cells/well의 농도로 파종하고 상기의 배양액으로 각 지지체당 3개씩 정적 배양하였다.
실험에 사용된 세포주 RAW 264.7 (Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line, KCLB 40071, KOREA)은 Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO)과 1% antibiotics (penicillin 100 units/mL 및 streptomycin 100 μg/mL)가 포함된 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, low Gibco)을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하여 실험에 사용하였다.
천마는 전남 무주군 적상면 사천리 행복과수원에서 2014년 11월에 수확하여 자연 건조시킨 절편을 구입하여 사용하였다. 천마 절편은 각각 80℃의 물, 60℃의 70% EtOH 및 60℃의 EtOH로 6시간 동안 추출하였고, 추출액은 여과지(Advantec No.2)를 이용하여 불순물을 제거한 다음 회전 증발 농축기(Rotary evaporator N-1000SW, Eyela)를 이용하여 감압 농축(40℃, 80 rpm, -0.08 Mpa) 시키고 -70℃의 초저온 냉동고(Deep freezer DE8514, Ilshin Lab co. Ltd, Korea)에 24시간 보관 한 후 -60℃, 5 mTorr에서 동결 건조(Lyophilizer FD5508, Ilshin Lab co, Ltd, Korea) 시킨 다음 실험에 사용하였다.
천마 추출물을 EM으로 발효시키기 위하여 사용된 EM 활성액은 에버미라클(www.evermiracle.com)에서 구입하여 사용하였다. 용매별로 추출한 추출물을 발효시키기 위해 EM 활성액은 6%, 설탕은 5%로 하였으며 37℃ 인큐베이터에서 7일간 발효시켜 실험에 사용하였다.
천마는 전남 무주군 적상면 사천리 행복과수원에서 2014년 11월에 수확하여 자연 건조시킨 절편을 구입하여 사용하였다. 천마 절편은 각각 80℃의 물, 60℃의 70% EtOH 및 60℃의 EtOH로 6시간 동안 추출하였고, 추출액은 여과지(Advantec No.

이론/모형

세포 생존율 측정은 Ko와 Kim의 방법[17]에 따라, RAW 264.7 cells를 96 well plate에 3×105 cells/well의 밀도로 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양시킨 후 각 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다.
천마 추출물 중의 g당 총 폴리페놀 함량을 측정하기 위하여 Folin-Danis 방법[14]을 이용하였다. 추출시료 100 μL와 2% Na₂CO₃ 1 mL를 혼합한 후 상온에서 2분 동안 반응 시키고 다시 50% Folin-Ciocalteu's phenol reagent 100 μL를 첨가하여 30 분 동안 상온에서 반응시켰다.
천마 추출물 중의 g당 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위하여 diethylene glycol 비색 방법[13]을 이용하였다. 추출시료 100 μL와 1N NaOH 100 μL, diethylene glycol 1 mL를 혼합한 후 30℃ water bath에서 1시간 동안 반응 시켰다.

성능/효과

70% EtOH 추출물의 경우 Fig. 1에서 보는 바와 같이 발효를 시키지 않았을 때는 0.725 mg/mL에서 23.92 ± 0.6%, 5 mg/mL에서는 29.21 ± 0.5%로, 젖산균으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 22.83 ± 0.7%, 5 mg/mL에서는 27.59 ± 0.8%로 약간씩 증가하였으나 EM으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 26.44 ± 0.8%, 5 mg/mL에서는 40.37 ± 1.2%로 크게 증가하여 70% EtOH 추출물을 EM으로 발효시킬 경우 DPPH radical scavenging 효과가 좋아짐을 알 수 있었다.
항산화 효과가 우수한 물질로 알려진 플라보노이드와 폴리페놀의 함량은 EtOH 추출물 > 70% EtOH 추출물 > Water 추출물 순으로 함량이 높게 나타났다. DPPH radical 소거능은 EtOH 추출물을 EM으로 발효시켰을 때 활성이 가장 높게 나타났으며, 이어서 젖산을 발효시킨 후 얻어진 물질로 나타나 천마를 발효를 시킬 경우 더욱 효과적으로 DPPH radical을 소거할 수 있음을 확인하였다. 미백 효과를 측정을 위한 tyrosinase 활성 저해 실험에서는 EtOH 추출물을 젖산균으로 발효시켰을 때 가장 저해 효과가 우수하였고, RAW 264.
EM으로 발효 시켰을 때에는 0.725 mg/mL 27.3 ± 0.8%, 5 mg/mL에서는 35.6 ± 1.8%로 증가하여 전반적으로 실험 농도 범위 내에서 농도 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다.
EM으로 발효 시켰을 때에는 0.725 mg/mL에서 22.1 ± 1.1%, 5 mg/mL에서는 31.4 ± 1.2%로 증가하여 70% EtOH 추출물을 젖산으로 발효시킬 경우 tyrosinase 저해 활성에 매우 효과적임을 알 수 있었다.
EM으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 24.3 ± 1.1%, 5 mg/mL에서는 33.6 ± 0.8%로 증가하여 물 추출물을 젖산균으로 발효 시킬 경우 tyrosinase 저해 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
EtOH 추출물의 경우 Fig. 3에서 보는 바와 같이, 발효를 시키지 않았을 때는 0.725 mg/mL에서 24.42 ± 0.9%, 5 mg/mL에서는 32.20 ± 0.8%로 증가하였으며, 유산균으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 21.60 ± 0.3%, 5 mg/mL에서는 30.53 ± 0.7%로 증가하였고, EM으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 27.06 ± 0.8%, 5 mg/mL에서는 47.09 ± 0.6%로 크게 증가하여 EtOH 추출물을 EM으로 발효시킬 경우 DPPH radical 소거에 매우 효과적임을 알 수 있었다.
RAW 264.7 Cells에서의 세포 생존율은 물 추출물, EtOH 추출물 및 70% EtOH 추출물과 이들을 발효 시킨 물질을 정상세포와 비교하여 보았을 때 Fig 7에서 볼 수 있는 바와 같이 모두 85%이상의 세포 생존율이 보였다. 이로써 추출물을 발효시킨 물질이 화장품 및 기능성 식품 소재로서 활용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
7 cells을 이용한 세포 생존율 실험 결과 물, EtOH, 70% EtOH 추출물과 이들의 발효 물질 모두 85%이상의 세포 생존율을 나타내 천마 추출물을 발효 시킬 경우 세포의 염증에 대한 안정성이 더욱 증가함을 확인하였다. ROS 생성으로 인한 항산화 실험에서는 양성 대조군으로 RAW 264.7 cells을 LPS로 자극시켜 활성화된 세포에 비발효와 발효에 따른 추출물을 농도별로 처리하였을 때, EM으로 발효시켰을 경우가 항산화성이 가장 높게 나타났다. 이상과 같이 천마 추출 및 발효 물질에 대한 플라보노이드와 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거능, tyrosinase 활성 저해력, 세포 생존율, ROS 생성 등을 측정한 결과 천마 추출물을 발효시켰을 경우 화장품용 소재로 활용할 수 있음을 확인하였다.
ROS 소거능으로 천마의 추출물을 확인하기 위하여 음성 대조군으로는 RAW 264.7 Cells 배양하였으며, 양성 대조군으로는 RAW 264.7 Cells 세포와 염증 유발 물질인 Lipopolysaccharide (LPS)를 사용하였을 때 음성 대조군으로 대식세포만 배양한 군에서는 가장 약한 DCH 형광세기로 최대한의 ROS 생성을 보여주었다.
물 추출물의 경우 Fig. 2에서 보는 바와 같이, 발효를 시키지 않았을 때는 0.725 mg/mL에서 0.49 ± 0.08%, 5 mg/mL에서는 27.41 ± 0.4% 로 증가하였으며, 유산균으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 18.08 ± 1.2%, 5 mg/mL에서는 26.14 ± 0.8%로 증가하였고, EM으로 발효시켰을 때는 0.725 mg/mL에서 23.91 ± 0.5%, 5 mg/mL에서는 29.38 ± 0.5%로 증가하여 전반적으로 실험범위 내에서 농도 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다.
DPPH radical 소거능은 EtOH 추출물을 EM으로 발효시켰을 때 활성이 가장 높게 나타났으며, 이어서 젖산을 발효시킨 후 얻어진 물질로 나타나 천마를 발효를 시킬 경우 더욱 효과적으로 DPPH radical을 소거할 수 있음을 확인하였다. 미백 효과를 측정을 위한 tyrosinase 활성 저해 실험에서는 EtOH 추출물을 젖산균으로 발효시켰을 때 가장 저해 효과가 우수하였고, RAW 264.7 cells을 이용한 세포 생존율 실험 결과 물, EtOH, 70% EtOH 추출물과 이들의 발효 물질 모두 85%이상의 세포 생존율을 나타내 천마 추출물을 발효 시킬 경우 세포의 염증에 대한 안정성이 더욱 증가함을 확인하였다. ROS 생성으로 인한 항산화 실험에서는 양성 대조군으로 RAW 264.
실험 결과 tyrosinase 저해 활성은 농도가 증가할수록 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 추출 용매별로는 EtOH > Water > 70% EtOH, 발효 방법에 따라서는 젖산균 발효 > 비발효 > EM 발효 순으로 나타났다.
실험 결과 전자 공여능(EDA %: Electron Donating Ability)으로 표시된 DPPH radical 소거능은 농도가 증가할수록 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 추출용매별로 보면 EtOH > 70% EtOH > Water 순이었고, 발효여부에 따라서는 EM 발효 > 유산균 발효 > 비발효 순으로 나타났다.
양성 대조군으로 대식 세포가 LPS로 자극되어 활성화된 세포에 비발효와 발효에 따른 추출물을 농도별 50 μL, 125 μL, 250 μL로 처리하였을 때 형광의 세기가 양성 대조군과 비교하였을 때 EM 발효> 비발효 > 젖산균발효 순으로 효과가 있는 것으로 나타났다.
이 실험 결과는 천마 추출물을 효모로 발효시킨 1, 2, 4, 8 mg/mL의 농도 범위에서 각 각 17.89, 32.62, 57.53, 84.48%라고 보고한 Park 등의 실험 결과[9]와 유사한 경향을 나타내어, 천마 추출물을 발효시킬 경우 균주가 다르지만 DPPH 라디칼 소거작용은 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
7 Cells에서의 세포 생존율은 물 추출물, EtOH 추출물 및 70% EtOH 추출물과 이들을 발효 시킨 물질을 정상세포와 비교하여 보았을 때 Fig 7에서 볼 수 있는 바와 같이 모두 85%이상의 세포 생존율이 보였다. 이로써 추출물을 발효시킨 물질이 화장품 및 기능성 식품 소재로서 활용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
7 cells을 LPS로 자극시켜 활성화된 세포에 비발효와 발효에 따른 추출물을 농도별로 처리하였을 때, EM으로 발효시켰을 경우가 항산화성이 가장 높게 나타났다. 이상과 같이 천마 추출 및 발효 물질에 대한 플라보노이드와 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거능, tyrosinase 활성 저해력, 세포 생존율, ROS 생성 등을 측정한 결과 천마 추출물을 발효시켰을 경우 화장품용 소재로 활용할 수 있음을 확인하였다.
천마를 물, EtOH (Ethanol) 및 70% EtOH로 추출하고, 추출된 물질을 젖산균과 EM (Effective Microorganisms)으로 발효 시킨 후 발효 방법에 따른 화장품 소재로써의 활용 가능성을 확인하였다. 항산화 효과가 우수한 물질로 알려진 플라보노이드와 폴리페놀의 함량은 EtOH 추출물 > 70% EtOH 추출물 > Water 추출물 순으로 함량이 높게 나타났다.
양성 대조군으로 대식 세포가 LPS로 자극되어 활성화된 세포에 비발효와 발효에 따른 추출물을 농도별 50 μL, 125 μL, 250 μL로 처리하였을 때 형광의 세기가 양성 대조군과 비교하였을 때 EM 발효> 비발효 > 젖산균발효 순으로 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히 EM 발효물에서 ROS 소거 효과가 가장 높은 것으로 알 수 있었다. 이는 망고를 EM으로 발효시킨 물질에 대한 연구 결과와 유사하였다 [23].
플라보노이드는, 80℃ 물 추출물에서는 6.83 ± 2.14 mg/g, EtOH 추출물에서는 23.33 ± 3.25 mg/g, 70% EtOH 추출물에서는 33.99 ± 2.45 mg/g이 얻어져 70% EtOH로 추출 하였을 때 가장 많은 플라보노이드가 얻어졌다.
항산화 효과가 우수한 물질로 알려진 플라보노이드와 폴리페놀의 함량은 EtOH 추출물 > 70% EtOH 추출물 > Water 추출물 순으로 함량이 높게 나타났다.

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A. N. Park, Ph. D. Dissertation, Anti-oxidative activities of unfermented and microbial fermented mango leaf extracts, Chonbuk National Univ., Chunbuk, Korea (2014).

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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