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구기자 추출성분의 항발암 효과 및 비타민 C첨가에 의한 상승효과
Enhancement of Anticarcinogenic Effect by Combination of Lycii fructus with Vitamin C 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.31 no.1, 2002년, pp.143 - 148  

박윤자 (신라대학교 식품영양학과) ,  김미향 (신라대학교 식품영양학과) ,  배송자 (신라대학교 식품영양학과)

초록
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예부터 약용 또는 식용으로 쓰였으며, 사람의 체질을 강하게 하고, 혈관연화, 콜레스테롤 저하작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 구기자를 추출, 분획하여 4종의 암세포 주(HepG2, HeLa, MCF-7, C6)를 이용하여 암세포 증식억제 실험을 한 결과, 4종의 암세포주 모두에게 구기자의 ethyl-ether층(LFMEE)이 아주 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났으며, 특히 유방암세포주인 MCF-7에서도 hexane층 (LFMH)에서 아주 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났다. 한편, 인체 간암세포인 HePG2를 이용하여 quinone reductase 효소 유도 활성 여부를 측정한 결과 분획물 첨가농도 100 $\mu\textrm{g}$/mL에서 1.85배의 높은 효과가 나타났다. 구기자에 미치는 비타민 C의 암세포 성장억제 상승효과를 실험한 결과, 구기자와 비타민 C를 각각 혼합 처리시 낮은 농도에서도 아주 높은 암세포 증식억제 효과가 나타났다. 즉, HeLa와 MCF-7 암세포주에서도 정도의 차이는 있었으나, 구기자 성분과 비타민 C의 조합에 의해 암세포 증식이 억제 또는 사멸되는 나타났으며 본 연구에서 사용한 2종류의 암세포주 모두 구기자와 비타민 C 혼합물의 투여로 인해 증식억제가 현저히 상승됨을 보여주었다. 본 실험을 통해, 구기자의 hexane층(LFMH)과 ethylether층(LFMEE)에서 높은 암세포 증식억제 효과와 암예방 효과가 있는 것으로 추정되며, 비타민 C와 함께 첨가했을 때 낮은 농도의 첨가 시료에서도 높은 암세포 증식억제 상승효과가 나타났음을 알 수 있었다. 구기자의 항암 효과를 상승시키기 위해서는 비타민 C 일정량을 함께 첨가하는 것이 효과적임을 본 실험 결과를 통해 알 수 있었다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

We investigated the cytotoxicity effects of Lycii fructus (LF) on HePG2, MCF7 and C6 cell lines by the MTT assay. We extracted the methanol (LFM) and fractionated to five partition layers. Among partition layers, the ethylether partition layer (LFMEE) was showed the strongest cytotoxic effects on al...

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

  • HepG2, C6 세포주는 MEM medium에, HeLa와 MCF-7 세 포주는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum (FBS) 고!" 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycindl 함유된 것으로 상기 4종의 암세포(HepG2, HeLa, MCF-7, C6)를 일주일 에 2 ~3회 정도 새로운 배 지 로 교환하고 flask에 암세포가 5 X104 cells/mL정도 증식 되면 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.0)으로 세 척 히-고 trypsin-EDTA로 처리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배양액으로 암세포가 골고루 분산되도록 희석하여 T-75flask에 IOii丄씩 분할 주입하고 4~5일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
  • QR 생성 유도효과는 Prochaska와 Santomaria의 방법 (19, 20)을 일부 변형하여 측정하였다.
  • 구기자의 암세포 증식 억제 효과를 규명하기 위해 MTT assay를 이용하여 인체 간암세포주인 HepG2, 자궁경 부암 세포주인 HeLa, 유방암세포주인 MCF-7 및 신경교종세포주인 C6에 대한 암세포 증식 억제 효과를 Fig. 1, 2, 3 및 4에 나타내었다.
  • 이 배양액에 MTT용액을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거한 후 DMSO와 ethanol을 1 -1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-spectrophotometer를 이용하여 570 nm와 690 nm에서 각각 측정하여 암세포 증식 억제효과를 비교 분석하였다. 그리고, 같은 방법으로 구기자의 각 분획물에 비타민 C 20 Ug/mL를 첨가하여 암세포에 대한 증식 억제 상승효과 여부를 측정하였다.
  • 본 연구에서는 각각의 인체 암세포주를 lx IO, cells/well 의 농도로 하여 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에 배 양한 후 시료의 용매 별 분획물을 각각 일정 량의 dimethyl sulfoxide①MSO)에 녹여 100, 200, 300, 400 및 500 l】g/well의 농도로 첨가하고, 48시간 동안 다시 배양하였다. 이 배양액에 MTT용액을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거한 후 DMSO와 ethanol을 1 -1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-spectrophotometer를 이용하여 570 nm와 690 nm에서 각각 측정하여 암세포 증식 억제효과를 비교 분석하였다.
  • 본 연구에서는 구기자의 메탄올 추출물을 각 용매별로 5층의 분획물로 나누고, 각 분획물 일정량을 인체 암세포주에 첨가함으로써 각 추출물의 암세포 증식 억 제 효과(cytotoxicity) 와 암예 방 quinone reductase(QR)의 유도활성 효과를 비교 측정한 후, 가장 대표적인 항산화제 인 비타민 C를 첨가함으로써 암세포. 증식억제에 대한 상승효과를 비교, 측정하여 인체 암세포주에 미치는 가용매 분획별 구기자 성분들의 암세포에 대한 생리활성 및 암예방 효과를 검토하였다.
  • 배지가 제거된 긱- well에 250 UL의 lysis buffer를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에 10분간 두면서 cell lysis 하였다. 여기서 반응액을 최총 농도가 10 mM Tris-Cl(pH 7.4), 0.5 mg/mL BSA, 0.008% Tween-20, 40 pM glucose-6-phosphate, 2 U/mL glucose-6-phosphate dehydrogenase, 2511M NADP, 40 Ug/mL 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5 -diphenyltetrazolium bromide(MTT) 및 1 mM menadione이 되도록 1 mL의 효소 용익을 첨가하여, 5분간 반응시킨 후, 반응 정지액인 10.3 mM dicumaro], 0.5% pyridine, 5 mM potassium phosphate(pH 7.4) 흔합액을 250 rL씩 첨가하여 효소 반응을 정 지 시 키 고, UV-visible spectrophotometer를 이용하여 610nm에서 흡광도를 측정하였다- 단백질량은 동일한 set의 cell plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정 량하였다. Quinone reductase 활성 측정 (nmol/min/mg protein)^ 다음과 같이 하였다.
  • 6%)의 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 hexane(LFMH), ethylether(LFMEE), ethylacetate(LFMEA), butanol(LFMB) 및 수층(LFMA)의 용매별로 분획 하여 LFMH층은 3.3 g(4.1%), LF-MEE층은 0.4 g(0.4%), LFMEA층은 0.7 g(Q9%) 및 LFMB 층은 24.6 g(30.2%)을 얻었고, 나머지 LFMA층은 52.4 g (64.4%)의 분획물을 얻었다.
  • 동결건조하여 methanol 추출물로 사용하였다. 메탄올 추출물을 다시 hexane(LFMH), ethylether(LFMEE), eth-ylacetate(LFMEA), butanol(LFMB) 및 수층(LFMA)의 순서로 각각 분획 하고 각 분배층을 감압 농축하여 건조시킨 후 분말로 만들어 시료로 사용하였다.
  • 배양하였다. 이 배양액에 MTT용액을 100 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거한 후 DMSO와 ethanol을 1 -1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-spectrophotometer를 이용하여 570 nm와 690 nm에서 각각 측정하여 암세포 증식 억제효과를 비교 분석하였다. 그리고, 같은 방법으로 구기자의 각 분획물에 비타민 C 20 Ug/mL를 첨가하여 암세포에 대한 증식 억제 상승효과 여부를 측정하였다.
  • 암세포. 증식억제에 대한 상승효과를 비교, 측정하여 인체 암세포주에 미치는 가용매 분획별 구기자 성분들의 암세포에 대한 생리활성 및 암예방 효과를 검토하였다.
  • 5% 및 938%의 높은 암세포 증식 억 제 효과가 나타났다. 한편 본 연구에서는 구기자에 비타민 C의 암세포 증식억제 상승효과를 측정하기 위하여 거의 암세포 증식을 억제하지 않는 비타민 C의 농도인 20 Ug/mL를 구기자의 각 분획에 첨가하여 구기자의 각 분획물에 미치는 비타민 C의 암세포 증식억제 상승효과를 측정하였다.

대상 데이터

  • 본 실험 에 사용된 시 료인 구기 자는 부산 연산동 소재 한약방에서 구입하여 -70℃에서 보관하였으며, 이 시료를 추출-분획하여 인 체 암세 포주에 대한 암세포 증식 억제효과(cytotoxicity) 와 quinone reductase(QR)유도 활성 물질 검색에 사용하였다.
  • 본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2(human hepatocellular cancer) 자궁경부암 세포인 HeLa(human cervices adenocarcinoma), 유방암세포인 MCF~7(human breast adenocarcinoma, pleural effusion) 및 신경교종 세 포주인 C6(mouse glioma)로서 서울의과대학교 한국 세포주 은행으로부터 구입하였다.
  • 암세포 증식 억제 상승 효과를 실험하기 위해 첨가용 vitamin C를 Sigma사(St. Louis, USA)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.

데이터처리

  • Standard deviations have been omitted for simplicity. All data were significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
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참고문헌 (20)

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  19. Carmichael, J., De Graff, W.G., Gazder, A.F., Minna, J.D. and Mitchell, J.B. : Evalution of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res., 47, 936-942 (1987) 

  20. Park, H.J. : Induction of quinone reductase and its regulatory mechanism at the transcriptional level by Scutellaria baicalensis. Ph.D. Dissertation, Yonsei University (1998) 

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