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문제 정의
- 본 연구는 대두의 영양 성분이 농축된 것으로 알려진 대두 배아를 사용하여 생리활성이 우수한 성분으로 알려진 사포닌을 분리 . 정제하고 기 능성 식품으로 개발하고자 한다.
제안 방법
- Deoxyribose의 파괴 정도로 hydroxyl radical 생성 정도를 측정하였다. 간장획분의 반응성 산소 대사물에 의해 deoxyribose가 파괴되어 aldehyde가 생성되며 이 aldehyde는 산성용액에서 thiobarbituric acid와 반응하여 발색되는 것을 이용한 Haliiwell 등의 방법끼에 따라 측정하였다.
- HPLC는 water 510 pump(Rheodyne model 7125)은 YMC Pack ODS AM-303(5 ㎛, 250x4.6mm, i.d)와 YMC Pack ODS- AM-32-7(7 m, 250x10mm, id)을 사 용하였고, Detector는 Hitachi Variable Wavelength UV monitor(210nm)로 분석하였다찌
- Sprague Dawley (SD)계 횐쥐 (male rate: 160±10g)를 2주간 예비 사육한 다음, 그룹당 8마리씩 3개의 대두 배아 사포닌의 활성을 측정하였다. 사육 및 실험조건 은 매일 오후 18:00에 체중의 측정과 함께 칭량된 사 료를 제공하고 다음 날 사료 잔량을 칭 량하여 사료 섭 취 량을 계산하였다.
- 동물세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 Camichael 등의 방법%)에 따라 MTT assay를 실시하였다. 각 well 당 DMSO 150㎕를 가하여 30분간 교 반한 후 ELISA reader (Molecular Device Co.)로 550nm 에서 홉광도를 측정하여 성장역제 효과(Grouth inhibitory efffect(%)=[(대조구의 흡광도- 시료처리구의 흡 광도)/대조구의 흡광도)]X100)를 구하여 세포독성 활 성의 지표로 하였다. 또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 50% 억제하는 시료의 농도를 IGo으로 나타내었다.
- 간장 세포의 분획은 HEPES완충용액(lOmMHEPES, 10mM KCl, 280mM sucrose, pH 7.4)을 사용하여 미토 콘드리아, 마이크로솜 및 시토솔 획분으로 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowiy 등의 방법21)에 따라 측정하였다.
- 그리고 실험 그룹으로서 0.5% 및 1.0% 군의 시료조 성은 기본사료의 조성에서 대두 배아 사포닌을 각각 0.5% 및 1.0%를 첨가하는 대신 탄수화물 중의 com starch를 각각 0.5% 및 1.0%만큼 줄여서 조제하였다.
- 대두 배아 사포닌 획분인 SA-1, SA-2 및 SA-3을 각각 100~600μg/mL씩 첨가하여 농도별에 따른 mouse lympoid neoplasm인 P388 및 mouse leukemia인 L1210에 대하여 세포독성을 조사하였다.
- 대두 배아에서 추출한 조사포닌을 ODS column를 통과시킨 후 얻은 SA-1, SA-2 및 SA-3를 세포독성 실험에 사용하였다. 본 연구는 SA-1, SA-2 및 SA-3를 mouse lympoid neoplasm인 P388D1 cells과 mouse leukemia인 L1210 cell에 첨가하여 세포 독성을 실험하였다.
- 4에 나타내었다. 대두 배아의 메탄 올 추출물의 농도를 각각 100, 200, 300, 400, 500 및 600μg/mL씩 첨가하여 실험하였다. L1210 cells에 대한 성장을 각각 100 및 200μg/mL일 때 성장억제효과는 48.
- 대두배아 추출물을 감압 농축한 후 ODS column (230x18mm)에 넣고 메탄올 : 물 (60 : 40 및 70 : 30 v/v) 혼합액 1 Q 로 각각 용해시킨 후 감압 농축하여 각 획분을 TLC에 전개하였다. TLC로 전개한 결과 획분F-l (methanol : water, 60 : 40 v/v)은 사포닌 성분이 없는 것으로 나타났고 F-2(methanol : water, 70 : 30 v/v)는 TLC 상에서 낮은 Rf치를 나타낸 사포닌으로 Ehrlich's 시약에 의하여 양성반응을 나타낸 것으로 보 아 fiirostanol 사포닌으로 생각된다.
- 또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 50% 억제하는 시료의 농도를 IGo으로 나타내었다. 대조구는 시료 대신 증류수를 첨가하여 실험하였다.
- 본 실험에 사용한 기본사료(control group)의 조성은 탄수화물 59.5%(com starch 44.5% sucrose 15.0%), 단백질 18.0%(sodium-free casein), 지 질 15.0% (lard)로 하였고, 여기에 셀룰로오스(3.0%), 비타민 및 무기질 혼합 물을 각각 1.0% 및 3.5%로 첨가, 혼합하여 조제하였다.
- 산화적 스트레스의 유발요인인 활성산소종의 생성은 성인병 또는 노화를 촉진한다. 본 실험에서는 대두 배아 사포닌을 첨가한 식이군에서 히드록시 라디칼(hydroxy radical: . OH)의 생성에 영향을 미치는 항산화 실험을 하기 위해서 대두 배아에서 추출한 사 포닌 중 활성이 가장 높은 SA-1 획분을 사용하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 대두 배아 사포닌을 가각 0.
- 대두 배아에서 추출한 조사포닌을 ODS column를 통과시킨 후 얻은 SA-1, SA-2 및 SA-3를 세포독성 실험에 사용하였다. 본 연구는 SA-1, SA-2 및 SA-3를 mouse lympoid neoplasm인 P388D1 cells과 mouse leukemia인 L1210 cell에 첨가하여 세포 독성을 실험하였다. 각 시료에 대하여 P388과 L1210의 성장에 미치는 영향을 실험한 결과를 Table 2에 나타내었다.
- 본 연구는 대두의 영양 성분이 농축된 것으로 알려진 대두 배아를 사용하여 생리활성이 우수한 성분으로 알려진 사포닌을 분리 . 정제하고 기 능성 식품으로 개발하고자 한다.
- 과산화수소(hydrogen peroxide)의 생 성 량은 Thurman 등끼에 따라 실시하였다. 분광광도계를 이용하여 파 장 480nm에서 홉광도를 측정하여 표준 검 량선에 의해 과산화수소(nmol/mg protein/min)의 함량을 정량하였다
- Sprague Dawley (SD)계 횐쥐 (male rate: 160±10g)를 2주간 예비 사육한 다음, 그룹당 8마리씩 3개의 대두 배아 사포닌의 활성을 측정하였다. 사육 및 실험조건 은 매일 오후 18:00에 체중의 측정과 함께 칭량된 사 료를 제공하고 다음 날 사료 잔량을 칭 량하여 사료 섭 취 량을 계산하였다. 동물사육실은 자동 조절(22±2℃ : 65±2% RH)되고, 명암은 12시간 사이클(18:00~06:00)로 자동 조절된다.
- 정제하여 유리기 억제효과 및 동물의 암세포에 대한 세포 독성을 조사 하였다. 유리기 억제활성에 대한 결과를 보면 대두 배 아 saponin을 0.5 및 1.0%씩 첨가한 급여 식에서 4주 동안 사육한 후 간장을 절취하여 간장 획분의 활성산 소 및 항산화 관련 효소에 대하여 평 가하였다. 간장의 mitochondria 및 microsome 획분의 hydroxy radical( .
- 대두 배아로부터 saponin을 분리 . 정제하여 유리기 억제효과 및 동물의 암세포에 대한 세포 독성을 조사 하였다. 유리기 억제활성에 대한 결과를 보면 대두 배 아 saponin을 0.
- 조사포닌 획분을 Shimoyamada 등의 방법*)에 따라 정제하였다. 조사포닌은 ODS column choromato- graphy(YMC GEL ODS-A ; 230x18mm, i.d)에 methanol : water(60 : 40 v/v) 로 평형 시킨 다음 methanol : water (50 : 50 v/v)로 용리시키고 이들 획분을 농축하여 활성을 측정하였다(Fig. 1).
- 한편 간장의 cytosol 획분 중 superoxide radical(C)2 - )의 생성에 미치는 영향을 실험하였다. Fig.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 대두 배아max Merrill)는 경남 김해시 진영읍 소재 신광식품산업사로부터 건조 대두 배아를 공급받아 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 대두 배아는 대두에 물을 뿌려 일 정 한 습도를 유지하면서 3~5일간 방치하여 발아시키 면 배아가 형성되는데 이를 건조하여 제품으로 하였다. 대두의 종자 부위별 배당체의 함량은 종피(種皮), 자엽(子葉) 및 배아{胚芽)의 경우 각각 0.
- 세포독성의 측정을 위해 사용한 동물세포주는 한국세포 주은행에서 L1210 (Lympocytic leukemia, mouse, ATCC CCL-219), P388Dl(Lympoid neoplasm, mouse, ATCC CCL-46)을 구입하였다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치 와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군 간의 유의성검정은 Students t-test로 실시하였다.
이론/모형
- 간장 획분 중의 수퍼 옥시 드 라디 칼(superoxide radi- cal:O2 - )의 생성 량은 McCord 와 Frodovch의 방법깨에 따라 superoxide dismutase를 억제할 수 있는 ferricytochrome C의 환원속도를 측정하였다. O.
- Deoxyribose의 파괴 정도로 hydroxyl radical 생성 정도를 측정하였다. 간장획분의 반응성 산소 대사물에 의해 deoxyribose가 파괴되어 aldehyde가 생성되며 이 aldehyde는 산성용액에서 thiobarbituric acid와 반응하여 발색되는 것을 이용한 Haliiwell 등의 방법끼에 따라 측정하였다.
- 과산화수소(hydrogen peroxide)의 생 성 량은 Thurman 등끼에 따라 실시하였다. 분광광도계를 이용하여 파 장 480nm에서 홉광도를 측정하여 표준 검 량선에 의해 과산화수소(nmol/mg protein/min)의 함량을 정량하였다
- 동물세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 Camichael 등의 방법%)에 따라 MTT assay를 실시하였다. 각 well 당 DMSO 150㎕를 가하여 30분간 교 반한 후 ELISA reader (Molecular Device Co.
- 4)을 사용하여 미토 콘드리아, 마이크로솜 및 시토솔 획분으로 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowiy 등의 방법21)에 따라 측정하였다.
- 조사포닌 획분을 Shimoyamada 등의 방법*)에 따라 정제하였다. 조사포닌은 ODS column choromato- graphy(YMC GEL ODS-A ; 230x18mm, i.
성능/효과
- Fig. 3는 대두 배아의 획분인 SA-1 을 P388D1의 성 장억제효과를 알아보기 위하여 각각 100, 250 및 300 μg/mL의 농도로 첨가한 결과 각각 46.3, 89.5 및 98.0%로 추출물의 농도가 증가할수록 억제효과가 증가하는 용량 의존형 억제효과를 나타내었으며 추출물을 500 μg/mL 이상 첨가하여 관찰한 결과 95.0%로 일정 수준 의 억제효과를 유지하였다. 또 대두 배아의 사포닌 획 분을 L1210 cells에 대한 성장에 미치는 영향에 대한 실험한 결과를 Fig.
- 각 시료에 대하여 P388과 L1210의 성장에 미치는 영향을 실험한 결과를 Table 2에 나타내었다. SA-1, SA-2 및 SA-3를 P388D1에 대해 각각 200μg/mL 씩 첨가한 결과 각각 20.6, 48.4 및 15.3%의 높은 성장 억제효과를 나타내었다. 또한 대두 배아로부터 분 리 .
- 대두배아 추출물을 감압 농축한 후 ODS column (230x18mm)에 넣고 메탄올 : 물 (60 : 40 및 70 : 30 v/v) 혼합액 1 Q 로 각각 용해시킨 후 감압 농축하여 각 획분을 TLC에 전개하였다. TLC로 전개한 결과 획분F-l (methanol : water, 60 : 40 v/v)은 사포닌 성분이 없는 것으로 나타났고 F-2(methanol : water, 70 : 30 v/v)는 TLC 상에서 낮은 Rf치를 나타낸 사포닌으로 Ehrlich's 시약에 의하여 양성반응을 나타낸 것으로 보 아 fiirostanol 사포닌으로 생각된다. 획 분 F-3 (methanol faaction)는 Ehrlich's 시 약에 의하여 음성 반응을 나타내 었고 Rf치가 다른 점 으로 보아 순수한 saponin이 아닌 것으로 사료된다.
- 대두 배아 사포닌의 세포독성을 P338 (mouse lyou- poid neoplasm)과 L1210 (mouse leukemia) 세포주를 사용하여 실시한 결과 200μg/mL 농도에서 높은 성장억 제효과를 나타내었다. 그리고 처리 농도에 따른 대두 배아 추출물이 P338과 L1210에 대한 성장 효과 실험 에서도 200μg/mL에서 높은 성장억제 효과가 나타났 으며 농도가 높을수록 완전히 억제되는 것을 볼 수 있었다.
- 대두 배아 사포닌의 세포독성을 P338 (mouse lyou- poid neoplasm)과 L1210 (mouse leukemia) 세포주를 사용하여 실시한 결과 200μg/mL 농도에서 높은 성장억 제효과를 나타내었다. 그리고 처리 농도에 따른 대두 배아 추출물이 P338과 L1210에 대한 성장 효과 실험 에서도 200μg/mL에서 높은 성장억제 효과가 나타났 으며 농도가 높을수록 완전히 억제되는 것을 볼 수 있었다.
- 5 μg /mL와 64, 80 및 55 μg/mL 로 나타났다. 동물세 포에 대한 대두 배아의 사포닌 획분의 첨가 농도별 P388D1 및 L1210에 대하여 세포독성이 비교적 높게 나타났다. 이러한 결과는 대두 배아로부터 분리 .
- )로 550nm 에서 홉광도를 측정하여 성장역제 효과(Grouth inhibitory efffect(%)=[(대조구의 흡광도- 시료처리구의 흡 광도)/대조구의 흡광도)]X100)를 구하여 세포독성 활 성의 지표로 하였다. 또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 50% 억제하는 시료의 농도를 IGo으로 나타내었다. 대조구는 시료 대신 증류수를 첨가하여 실험하였다.
- 획 분 F-2-2를 다시 HPLC로 재용리 (acetonitrile : water, 44 : 56 v/v) 시켜 SA-1, SA-2 및 SA-3을 얻었다. 이들 중 SA-1의 획분을 DPPH와 POV를 측정한 결과 항산화 활성이 가장 높은 것으로 나타났다 .
- 또한 대두 배아로부터 분 리 . 정제한 사포닌을 사용하여 L1210 cells에 대한 억 제 효과를 조사한 결과 L1210에 대해 각각 200μg/mL 씩 첨가한 농도에서 각각 36.8, 40.4 및 43.0%의 성장 억제효과를 나타내었다.
후속연구
- OH, H2O2 및 O2 .등의 활성산소의 생성에 있어 유의적으로 억제 할 수 있었으므로 대두 배아에서 추출한 saponin이 생 체 방어작용에 효과적일 것으로 기대된다.
- 한편, 우리의 전통 장류에 대한 연구에서는 윤 등의 보고에 다르면 돌연변이원의 작용을 억제함으로써 암 발생 (initiation)을 예방하는 것으로 나타났으며28), 본 연구에서는 대두 배아가 in vitro assay에서 암세포의 성장 을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 앞으 로 암 세포주에 대한 세포독성을 나타내는 물질을 분 리 정제하여 그 구조를 밝히고, 동물실험을 통한 in vivo assay 확인 연구가 진행되어야 항암성을 확실히 밝힐 수 있을 것으로 사료된다.
- 의 생성 억제효과가 인정되었다. 본 실험 결과 대두 배아에서 추출한 사포닌은 활성 산소를 생 성하는 초기 단계에서 free redical의 생성을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
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