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문제 정의
- 청국장에서 혈전용해효소생성 균주 분리[5, 7, 11] 와 효소정제[5, 6, 21]에 관한 논문이 다수 발표되었으나 청국장을 직접 제조, 저장, 숙성 중의 기능성물질인 혈전 용해 효소에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 암모니아취가거의 나지 않으면서 기능성 물질인 혈전용해효소가 다른 청국장에 비하여 많이 포함된 청국장을 제조하고자 본 연구실에서 기능성 청국장 균주를 분리하고 분리된 균주를 이용한 기능성 청국장의 발효조건 및 식염첨가의 영향에 대하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 최적 발효온도와 시간을 검토하기 위해 선발된 종균을 접종한 증자 대두를 25에서 501 까지 범위의 여러 온도별 항온기에서 발효 72시간까지 6시간마다 시료를 채취하였다. 각 발효조건별로 제조한 청국장의 pH는 시간별로 채취한 시료를 동량의 증류수에 현탁하여 pH meter(ORION 420A, USA)로 측정하였다. 청국장 발효 중 균수변화는 직접도말법으로 측정하였다.
- 후 TSB (Trypticase Soy Broth, Difco, France)에 37℃, 24시간, 진탕 배양한 것을 종균으로 이용하였다. 남해산 대두를 정선하여 이물을 제거하고 3회 세척 후 실온에서 12 시간 침지 하였다. 물빼기는 1시간 실시하여 과잉의 수분을 제거하였다.
- 혈전용해효소의 열안정성을 조사하기위해 제조한 청국장을 증류수 현탁(1:1, w/v)하여 30℃에서 &T('범위의 항온수조에서 30분간 중탕처리 후 잔존하는 혈전용해활성을 측정하여 열안정성을 확인하였다. 또 청국장 중의 혈전 용해 효소 활성에 식염의 영향을 조사하기 위해 발효가 끝난 청국장을 멸균식염수(2%~20%)에 용출(1:4, w/v)하여 혈전 용해 활성을 측정하였다.
- 이 등[12]은 청국장을 제조하여 가열처리 하였을 때 10(rc에서 5분, 30분간 가열 처리 후혈전용해 효소의 역가는 각각 90%, 45%를 유지하였다고 보고한 바 본 실험의 결과와 유사하였다. 또한 청국장 관련 보고들에서 식염을 첨가한 후 연구결과나 혈전용해효소와 관련한 보고가 거의 없는 실정으로 발효시킨 청국장을 농도별 식염수에 용출 후 혈전용해효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 식염의 농도가 2~20%까지 혈전용해효소의 활성은 거의 감소되지 않았다.
- 발효시간을 설정하기 위해 혈전용해효소 생산량과 암모니아취 형성 유무를 확인하였다. 혈전용해효소는 발효 6시간 이후부터 12시간까지 급격히 증가하여 24시간에 최대 활성을 나타내었으나 24시간 이후에는 서서히 감소하였다 (Fig.
- 분리 균주를 TSA (Trypticase Soy Agar, Difco, France)에 계대 후 TSB (Trypticase Soy Broth, Difco, France)에 37℃, 24시간, 진탕 배양한 것을 종균으로 이용하였다. 남해산 대두를 정선하여 이물을 제거하고 3회 세척 후 실온에서 12 시간 침지 하였다.
- 분리한 균주로 청국장을 제조하여 청국장의 냄새와 맛, 색택, 점 질물 생성 량, 암모니아취가 등을 조사하였다. 특히 혈전용해효소를 많이 생산(Fig.
- 즉, 각 시간별 시료 10g을 멸균증류수 9㎖에 넣고 30분간 교반하여 시험액으로 사용하였다. 시험액을 10배씩 희석하여 NA (Nutri- ent Agar, Difco, France)에 도말하여 37℃에서 12시간배양후 생성된 colony를 계수하였다.
- 121℃에서 50분간 증자 한 후 45C까지 방냉하여 전배양한 종균을 원료 g당 106 되게 접종하여 통기 가능한 용기에 넣어 발효시켰다. 최적 발효온도와 시간을 검토하기 위해 선발된 종균을 접종한 증자 대두를 25에서 501 까지 범위의 여러 온도별 항온기에서 발효 72시간까지 6시간마다 시료를 채취하였다. 각 발효조건별로 제조한 청국장의 pH는 시간별로 채취한 시료를 동량의 증류수에 현탁하여 pH meter(ORION 420A, USA)로 측정하였다.
- 활성즉정 은 조효소액 20㎕를 paper disc ( 0 8mm, Toyo Roshi, Japan)에 흡수시킨 후 제조한 fibrin plate 올려 37°('에서 4시간 동안 반응 후 생성된 투명한 부위의 직경을 측정하였다. 혈전용해효소의 열안정성을 조사하기위해 제조한 청국장을 증류수 현탁(1:1, w/v)하여 30℃에서 &T('범위의 항온수조에서 30분간 중탕처리 후 잔존하는 혈전용해활성을 측정하여 열안정성을 확인하였다. 또 청국장 중의 혈전 용해 효소 활성에 식염의 영향을 조사하기 위해 발효가 끝난 청국장을 멸균식염수(2%~20%)에 용출(1:4, w/v)하여 혈전 용해 활성을 측정하였다.
- 혈전용해효소의 활성은 fibrin plate 법[1]을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. fibrin plate는 0.
- 분리된 균주의 생화학적 특성을 Bergey's의 방법 [2]에 준하여 동정하였다. 형태학적 특성은 gram 염색법으로 염색 후 현미경으로 검경하였으며, 운동성과 아포형성 유무를 확인하였다.
- 2)하여 여액을 조효소로 사용하였다. 활성즉정 은 조효소액 20㎕를 paper disc ( 0 8mm, Toyo Roshi, Japan)에 흡수시킨 후 제조한 fibrin plate 올려 37°('에서 4시간 동안 반응 후 생성된 투명한 부위의 직경을 측정하였다. 혈전용해효소의 열안정성을 조사하기위해 제조한 청국장을 증류수 현탁(1:1, w/v)하여 30℃에서 &T('범위의 항온수조에서 30분간 중탕처리 후 잔존하는 혈전용해활성을 측정하여 열안정성을 확인하였다.
대상 데이터
- 경남 남해군 서면 농협에서 2001년 가을 수확한 백태를구입 사용하였다.
- 서부경남 일대의 재래시장에서 유통되는 청국장과 장류 공장에서 분리한 균주 중 혈전용해능이 있는 균주를 분리하였다. 분리한 균주로 청국장을 제조하여 청국장의 냄새와 맛, 색택, 점 질물 생성 량, 암모니아취가 등을 조사하였다.
- 증자시킨 콩에 분리균주인 B. subtilis GSK3580를 접종하여 25~50℃범위에 10개 구로 나누어 청국장을 제조하였다. 본 연구에서 청국장의 품질은 기본적인 청국장의 물성 외에 기능성 물질인 혈전용해효소의 생산량이 중점이 된다.
- 분리한 균주로 청국장을 제조하여 청국장의 냄새와 맛, 색택, 점 질물 생성 량, 암모니아취가 등을 조사하였다. 특히 혈전용해효소를 많이 생산(Fig. 1)하는 기능성 청국장 제조에 적합한 균주를 선택하였다. 분리된 균주의 생화학적 특성을 Bergey's의 방법 [2]에 준하여 동정하였다.
- 이들 균주의 혈전용해활성은 50 unit/㎖이하가 138균주, 51 ~100 unit/㎖가 29균주, 100 unit/nrf이상이 16균주로 나타났다. 혈전용해효소 역가 100 unit/M이상인 균주로 청국장을 제조하여 암모니아취 및 이취를 거의 생성하지 않는 3 균주를 획득하였고 혈전용해효소생산량과 이취생성, 점 질물:, 색택 등이 가장 우수한GSK3580균주를 선택하였다. 기능성 청국장 제조에 적합한 균주의 형태학적, 생화학적 특성 등을 Table 1에 나타내었다.
이론/모형
- 1)하는 기능성 청국장 제조에 적합한 균주를 선택하였다. 분리된 균주의 생화학적 특성을 Bergey's의 방법 [2]에 준하여 동정하였다. 형태학적 특성은 gram 염색법으로 염색 후 현미경으로 검경하였으며, 운동성과 아포형성 유무를 확인하였다.
- 각 발효조건별로 제조한 청국장의 pH는 시간별로 채취한 시료를 동량의 증류수에 현탁하여 pH meter(ORION 420A, USA)로 측정하였다. 청국장 발효 중 균수변화는 직접도말법으로 측정하였다. 즉, 각 시간별 시료 10g을 멸균증류수 9㎖에 넣고 30분간 교반하여 시험액으로 사용하였다.
성능/효과
- 본 연구에서 청국장의 품질은 기본적인 청국장의 물성 외에 기능성 물질인 혈전용해효소의 생산량이 중점이 된다. 각각의 온도에서 제조한 청국장의 혈전용해효소 활성을 측정한 결과 37℃에서 가장 높았다(Fig. 2.). 40℃ 이상에서도 효소 활성은 나타났으나 37℃보다 상대적으로 낮았고, 암모니아취의 형성속도가 빠른 것으로 나타났다.
- 정상기 균수가 발효 48시간까지 유지되다가 이후에 감소하였다. 균수가 증가할수록 혈전용해효소의 활성도 증가하여 12시간에 최고 활성의 65%가 생산되었고, 24시간에는 최고 활성을 보였으나 24 시간 이후에는 균수의 변화에 상관없이 활성은 감소하였다.
- 또한 청국장 관련 보고들에서 식염을 첨가한 후 연구결과나 혈전용해효소와 관련한 보고가 거의 없는 실정으로 발효시킨 청국장을 농도별 식염수에 용출 후 혈전용해효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 식염의 농도가 2~20%까지 혈전용해효소의 활성은 거의 감소되지 않았다. 이로서 식염으로 조미한 청국장의 보존 및 섭취 시 식염에 의한 혈전용해효소의 저해는 일어나지 않을 것으로 사료된다.
- 이상의 특성을 근거로 Bacillus subtilisS. 동정되었으며 최종적으로 Bacillus subtilis GSK358Q로 명명하였다.
- 일본의 납두와는 달리 한국의 청국장은 가열하여 섭취하는 식품이다. 따라서 본 실험에서 제조한 청국장을 증류수에 현탁하여 30분간 열처리하여 혈전용해효소의 열 안정성을 조사 한 결과 3CTC와 40℃ 처리구에서 대부분 활성이 유지되었으나, 6(rc와 8(rc에서는 각각 75%, 40%정도 잔존하여 열안정성이 비교적 높았다. 이 등[12]은 청국장을 제조하여 가열처리 하였을 때 10(rc에서 5분, 30분간 가열 처리 후혈전용해 효소의 역가는 각각 90%, 45%를 유지하였다고 보고한 바 본 실험의 결과와 유사하였다.
- 또 암모니아취는 발효 30시간이후부터 후각으로 느낄 수 있었으며 발효 48시간이후에는 자극적이어서 부패 취로 인식될 만큼 증가하였다. 따라서 혈전용해효소의 활성이 가장 높고, 자극적인 암모니아취를 거의 형성하지 않으며, 점 질물 생성 량도 충분한 24시간을 최적 발효시간으로 설정하였다. 길 등[기도 혈전용해효소생성에 관한 보고에서도 발효 24시간 후 활성이 최대로 보고하였고, 김 등[8]은 B.
- 3). 또 암모니아취는 발효 30시간이후부터 후각으로 느낄 수 있었으며 발효 48시간이후에는 자극적이어서 부패 취로 인식될 만큼 증가하였다. 따라서 혈전용해효소의 활성이 가장 높고, 자극적인 암모니아취를 거의 형성하지 않으며, 점 질물 생성 량도 충분한 24시간을 최적 발효시간으로 설정하였다.
- 81 로 약 알칼리화 되었다. 본 혈전용해효소는 열안정성이 높아 60℃ 와 8(TC 에서 30분 처 리하였을 때 혈전용해활성을 각각 75% 와 40% 유지하였다.
- 기능성 청국장 제조에 적합한 균주의 형태학적, 생화학적 특성 등을 Table 1에 나타내었다. 분리된 균은 호기성, 간균으로 gram 양성이며 아포를 형성하는 것으로 밝혀졌다. 탄소원으로 glucose, fructose, mannitol, arabinose, cellulose 등을 이용하여 산을 생 성하였으며 rhamnose와 lactose는 이 용하지 못하였다.
- 이 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 결과 Bacillus subtilis로 동정 되었다. 분리 된 균주를 이용하여 혈전 용해 활성이 높은 청국장 제조를 위한 최적발효조건은 37℃ 에서 24시간이 었다.
- 었다. 이들 균주의 혈전용해활성은 50 unit/㎖이하가 138균주, 51 ~100 unit/㎖가 29균주, 100 unit/nrf이상이 16균주로 나타났다. 혈전용해효소 역가 100 unit/M이상인 균주로 청국장을 제조하여 암모니아취 및 이취를 거의 생성하지 않는 3 균주를 획득하였고 혈전용해효소생산량과 이취생성, 점 질물:, 색택 등이 가장 우수한GSK3580균주를 선택하였다.
- 재래시장 및 상점에서 구입한 청국장에서 분리한 124 균주, 장류공장에서 분리한 59균주를 TSB (Trypticase Soy Broth, Difco, France)에서 40℃, 48시간 진탕배양한 결과 각각 42균주, 28균주가 혈전용해효소생산 균주로 확인되 었다. 이들 균주의 혈전용해활성은 50 unit/㎖이하가 138균주, 51 ~100 unit/㎖가 29균주, 100 unit/nrf이상이 16균주로 나타났다.
- 증자 직후 대두는 pH 6.3이었으나 발효 중 점차 증가하여 12시간에 pH 7.24, 24시간에는 pH 7.54, 48시간 발효 후에는 pH 7.81 로 증가하여 약알칼리성화 되었다(Fig. 4). 청국장 발효과정 중의 pH 변화에 관한 연구는 김 등[9]의 전통 청국장 발효 시 초기 pH 6.
- 증자대두에 B. subtilis GSK3580을 106 CFU/g 접종한 후 생육정도를 관찰한 결과 2시간의 유도기를 거친 후 발효 6시간째에 거의 정상기에 도달하였다(Fig. 5). 정상기 균수가 발효 48시간까지 유지되다가 이후에 감소하였다.
- 형성 유무를 확인하였다. 혈전용해효소는 발효 6시간 이후부터 12시간까지 급격히 증가하여 24시간에 최대 활성을 나타내었으나 24시간 이후에는 서서히 감소하였다 (Fig. 3). 또 암모니아취는 발효 30시간이후부터 후각으로 느낄 수 있었으며 발효 48시간이후에는 자극적이어서 부패 취로 인식될 만큼 증가하였다.
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