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문제 정의
- 75% TFA가 함유된 물과 아세토나이트릴을 사용하여 분리, 분석하였다. 혈액 속에 있는 적혈구 내의 생리활성 펩타이드를 RP-HPLC와 UV 검출기를 이용하여 분리하기 위한 실험조건을 정립하고, 펩타이드의 일부를 정성적으로 규명하는 것이 이 연구의 목적이다.
제안 방법
- 이론은 아직 없다. 다만 본 연구에서는 이와 같이 구조적 변화를 나타내는 펩타이드들을 RP-HPLC에 의하여 정량 및 정성적으로 확인하였다. 적혈구내에 있는 생리활성 펩타이드는 시간이 지남에 따라 스스로 분해하여 새로운 형태의 물질을 만들어낸다.
- 본 실험에서는 적혈구 내의 작은 펩타이드들을 분리하는 것이므로 5 ㎛의 C18으로 충전된, 공극의 크기가 100A를 사용하였다. 본 실험에서는 혈액을 채취한 날로부터 3일, 5일, 7일째 되는 날에 샘플시료를 만들었고, 0.75% TFA가 함유된 물과 아세토나이트릴을 사용하여 분리, 분석하였다. 혈액 속에 있는 적혈구 내의 생리활성 펩타이드를 RP-HPLC와 UV 검출기를 이용하여 분리하기 위한 실험조건을 정립하고, 펩타이드의 일부를 정성적으로 규명하는 것이 이 연구의 목적이다.
- 위와 같은 방법으로 시료를 만들었다. 위에서 얻은 4개 샘플 시료의 용매, 용리 시간에 따른 변화를 비교하기 위하여 분석용 HPLC를 사용하였다. 이동상은 0.
- 혈액를 채취한 날짜로부터 각각 3일째, 5일째, 7일째되는 날에 위와 같은 방법으로 시료를 만들었다. 위에서 얻은 4개 샘플 시료의 용매, 용리 시간에 따른 변화를 비교하기 위하여 분석용 HPLC를 사용하였다.
대상 데이터
- 10. TCA에 의해 혈액 속의 적혈구 및 단백질 성분들은 바닥에 침전되고 위쪽 부분에는 순수한 펩타이드 성분만이 남게 되고 이를 시료로 사용하였다. (Figure 1-(D) 참조)
- )를 사용하였다. HPLC 는 Waters사의 600S(solvent delivery system), UV 검출기는 2487 UV dual channel detector(Waters, Milford, MA, U.S.A.) 를 사용하였다. 데이터 저장 시스템은 HP Vectra 500 PC에 설치된 Millennium 3.
- trichloroacetic acid (TCA)는 Acros Organics에서, sodium citrate는 Shinyo pure chemical에서 구입하였다. HPLC-grade의 아세토나이트릴은 J. T. Baker에서 구입하였고 물은 2차 증류한 증류수를 사용하였다.
- 0 mL/min로 고정하였다. UV 검출기는 254 nm 를 사용하였고 모든 실험은 상온에서 수행하였다.
- trichloroacetic acid (TCA)는 Acros Organics에서, sodium citrate는 Shinyo pure chemical에서 구입하였다. HPLC-grade의 아세토나이트릴은 J.
- 광범위한 생리활성 물질 중에서 본 연구에서는 적혈구 내의 생리활성 펩타이드를 선정하였다(1). 생체의 기능조절에 관여하는 펩타이드로서 혈액 내에서 분비되는 양이 극히 적기 때문에 다양한 생리 기능을 밝히는데 어려운 점이 많았다.
- ) 를 사용하였다. 데이터 저장 시스템은 HP Vectra 500 PC에 설치된 Millennium 3.2 를 사용하였다. 분석용 컬럼 (4.
- 아미노산의 내부 분자의 일부분은 전기적인 전하를 띠는데, 극성인 이동상과 비극성인 정지상 사이에서 분리에 중요한 역할을 하게 된다(15, 16). 따라서 이동상은 극성인 물과 아세토나이트릴을 사용하였고 이온 첨가제로는 0.75% TFA를 사용하였다. 이러한 물질들의 특징을 이용하기 위해서는 일정용매 조성으로 분리하기는 거의 불가능하기 때문에(17), 선형적 구배용매 조성을 이용하여 펩타이드를 분리하였고, 구배시간과 단계를 변화시키면서 얻은 조건 중에서 가장 좋은 분리도를 보인 실험 결과가 Table 1에 나타나 있다.
- 본 실험에 사용된 샘플시료는 인하대학교 고순도 분리연구실에서 다음 단계를 거쳐서 직접 준비하였다(13, 14).
- 본 실험에 사용된 표준시료 펩타이드와 이온 첨가제인 trifluoroacetic acid (TFA)는 Sigmm에서 구입하였다. trichloroacetic acid (TCA)는 Acros Organics에서, sodium citrate는 Shinyo pure chemical에서 구입하였다.
- 일반적으로 실험에 사용되는 컬럼의 실리카 공극 크기(pore-size)는 펩타이드의 크기에 의존하는데, 매우 큰 펩타이드나 단백질은 300 A, 반면에 작은 펩타이드들은 (<125A)가 적합하다. 본 실험에서는 적혈구 내의 작은 펩타이드들을 분리하는 것이므로 5 ㎛의 C18으로 충전된, 공극의 크기가 100A를 사용하였다. 본 실험에서는 혈액을 채취한 날로부터 3일, 5일, 7일째 되는 날에 샘플시료를 만들었고, 0.
- 2 를 사용하였다. 분석용 컬럼 (4.60× 150 nun)은 Alltech 회사에서 구입한 것으로 C18 입자크기가 5 이고 공극의 크기가 100A를 사용하였다.
- 위에서 얻은 4개 샘플 시료의 용매, 용리 시간에 따른 변화를 비교하기 위하여 분석용 HPLC를 사용하였다. 이동상은 0.75% TFA가 포함된 물, 아세토나이트릴으로 구성하였다. 헬륨을 사용하여 이동상의 기체성분을 제거하였고 시료의 주입량은 10 pL, 이동상의 유속은 1.
- 혈액으로부터 생리활성 펩타이드를 얻어내기 위해 건강한 사람의 혈액을 채취하였다. 응고를 막기 위해 3.
성능/효과
- Figure 3에서는 7일째의 Figure 4와 유사하여 물질명을 표기하지 않았다. 각각의 크로마토그램을 분석한 결과 3일, 5일, 7일째 만들어진 샘플시료의 peak 형태는 거의 비슷했다. 단지 첫날 시료와 비교해서 4 분대에 peak #2가 추가되었다.
- 펩타이드를 RP-HPLC에 의해 정량, 정성분석 함으로 다양한 연구 분야로의 확대를 모색해볼 수 있다. 혈액 속에 있는 적혈구내의 펩타이드를 분리하기 위해 0.75% TFA가 포함된 물과 아세토나이트릴을 이동상과 선형적 구배용매 조성을 이용한 실험결과, 펩타이드의 peak 분리도는 상당히 우수하였다. 혈액을 채취한 날짜의 경과에 따라서 새로운 생리활성 물질이 만들어짐을 확인할 수 있었다.
- 75% TFA가 포함된 물과 아세토나이트릴을 이동상과 선형적 구배용매 조성을 이용한 실험결과, 펩타이드의 peak 분리도는 상당히 우수하였다. 혈액을 채취한 날짜의 경과에 따라서 새로운 생리활성 물질이 만들어짐을 확인할 수 있었다. 이와 같은 현상은 적혈구내의 세포들이 산소를 계속적으로 소비함으로써 산소 부족현상 때문에 발생하는 것으로 알려져 있고 구조적 변화를 나타나는 생리활성 펩타이드를 정성적으로 확인함으로써 좀더 의학적인 분야로의 연구를 수행할 수 있게 될 것이다.
후속연구
- 혈액을 채취한 날짜의 경과에 따라서 새로운 생리활성 물질이 만들어짐을 확인할 수 있었다. 이와 같은 현상은 적혈구내의 세포들이 산소를 계속적으로 소비함으로써 산소 부족현상 때문에 발생하는 것으로 알려져 있고 구조적 변화를 나타나는 생리활성 펩타이드를 정성적으로 확인함으로써 좀더 의학적인 분야로의 연구를 수행할 수 있게 될 것이다.
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