The determination of DNA hybridization reaction can apply the molecular biology research, clinic diagnostics, bioengineering, environment monitoring, food science and application area. So, the improvement of DNA hybridization detection method is very important for the determination of this hybridiza...
The determination of DNA hybridization reaction can apply the molecular biology research, clinic diagnostics, bioengineering, environment monitoring, food science and application area. So, the improvement of DNA hybridization detection method is very important for the determination of this hybridization reaction. Several molecular biological techniques require accurate predictions of matched versus mismatched hybridization thermodynamics, such as PCR, sequencing by hybridization, gene diagnostics and antisense oligonucleotide probes. In addition, recent developments of oligonucleotide chip arrays as means for biochemical assays and DNA sequencing requires accurate knowledge of hybridization thermodynamics and population ratios at matched and mismatched target sites. In this study, we report the characteristics of the probe and matched, mismatched target oligonucleotide hybridization reaction using thermodynamic method. Thermodynamic of 5 oligonucleotides with central and terminal mismatch sequences were obtained by measured UV-absorbance as a function of temperature. The data show that the nearest-neighbor base-pair model is adequate for predicting thermodynamics of oligonucleotides with average deviations for $\Delta$H$^{0}$ , $\Delta$S$^{0}$ , $\Delta$G$_{37}$$^{0}$ and T$_{m}$, respectively.>$^{0}$ and T$_{m}$, respectively.
The determination of DNA hybridization reaction can apply the molecular biology research, clinic diagnostics, bioengineering, environment monitoring, food science and application area. So, the improvement of DNA hybridization detection method is very important for the determination of this hybridization reaction. Several molecular biological techniques require accurate predictions of matched versus mismatched hybridization thermodynamics, such as PCR, sequencing by hybridization, gene diagnostics and antisense oligonucleotide probes. In addition, recent developments of oligonucleotide chip arrays as means for biochemical assays and DNA sequencing requires accurate knowledge of hybridization thermodynamics and population ratios at matched and mismatched target sites. In this study, we report the characteristics of the probe and matched, mismatched target oligonucleotide hybridization reaction using thermodynamic method. Thermodynamic of 5 oligonucleotides with central and terminal mismatch sequences were obtained by measured UV-absorbance as a function of temperature. The data show that the nearest-neighbor base-pair model is adequate for predicting thermodynamics of oligonucleotides with average deviations for $\Delta$H$^{0}$ , $\Delta$S$^{0}$ , $\Delta$G$_{37}$$^{0}$ and T$_{m}$, respectively.>$^{0}$ and T$_{m}$, respectively.
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문제 정의
본 논문에서는 UV-흡광도를 이용하여 열역학법에 의한 DNA hybridization을 측정하였으며, 최근접 염기대 모델 (nearest neighbor base-pair model)을 이용하여 얻은 상보적 및 각 미스매치 올리고뉴클레오티드의 반응 특성과 비교 분 석한 결과를 서술하였다. 이 결과를 바탕으로 상보적 및 각 미스매 치 올리고뉴클레오티드는 열역학적으로 차이가 있음을 확인하였으며, DNA칩 마이크로어레이나 전기화학적 방법을 이용한 DNA 센서 개발의 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
미스매치 올리고뉴클레오티드 MR-2와 MR-3은 중앙 부분과 말단부분에 한 개씩의 미스매 치 염기배열을 가졌으며, 미스매치 올리고뉴클레오티드 MR- 22와 MR-33은 중앙 부분과 말단부분에 두 개씩의 미스매치 염 기배열을 가졌다. 이 미스매치 올리고뉴클레오티드를 사용하여 미스매치 염기배열의 위치 및 개수가 DNA hybridization에 어떤 영향을 미치는지를 알아볼 수 있다.
가설 설정
이들 식으로부터 ΔH0 및 ΔS0의 값이 구해지며, 식 (2-3)으로부터 25℃와 37℃에서의 Δ6G250와 의 값을 얻을 수 있다. 여기서, ΔH0 및 ΔS0은 올리고뉴클레오티드 농도 및 온도에 의존하지 않는 값으로 가정한다. 이 방법으로 각 열역학적량을 구할 때는 적어도 100배 이상의 올리고뉴클레오 티드 농도 범위에서 5개 이상의 농도 포인트가 필요한 것으로 알려져 있으며, 이 측정에는 비교적 수작업이 필요하지만 Tm' vs.
제안 방법
염기배열중 밑줄친 부분은 미스 매치 염기 배열을 나타낸다. 미스매치 올리고뉴클레오티드 MR-2와 MR-3은 중앙 부분과 말단부분에 한 개씩의 미스매 치 염기배열을 가졌으며, 미스매치 올리고뉴클레오티드 MR- 22와 MR-33은 중앙 부분과 말단부분에 두 개씩의 미스매치 염 기배열을 가졌다. 이 미스매치 올리고뉴클레오티드를 사용하여 미스매치 염기배열의 위치 및 개수가 DNA hybridization에 어떤 영향을 미치는지를 알아볼 수 있다.
UV흡광도 및 온도의 프로파일(melting curves)은 DU 640 UV-vis spectrophotometer (BECKMAN, USA)를 사용하여 측정하였다. 열역학법에 의한 실험을 위해 모든 올리고뉴클 레오티드는 수용성 완충액(10mM Tris- HC1, 0.
UV흡광도 및 온도의 프로파일(melting curves)은 DU 640 UV-vis spectrophotometer (BECKMAN, USA)를 사용하여 측정하였다. 열역학법에 의한 실험을 위해 모든 올리고뉴클 레오티드는 수용성 완충액(10mM Tris- HC1, 0.2M NaCl, pH7.9)을 이용하여 O.lnM-10농도의 샘플로 각각 제작하였다. 실험전에 모든 샘플은 5분동안 실온에서 90℃까지 가 열시킨 후, 실온까지 다시 천천히 냉각시켜 프로브 올리고뉴 클레오티드와 표적 올리고뉴클레오티드를 쌍염기의 형태가 되도록 hybridization시 켰 다.
이후 모든 실험은 260nm 의 파장대에서 l℃/min 의 heating rate로 측정되었다. 온도가 올라가는 동안 260nm의 파장대에서 의 흡광도는 계속 기록되 었으며 쌍염기가 해리되는 융해곡선을 구하였다. 올리고뉴클레오티드의 각 농도에서 의 융해곡선으로부터 각각의 융해온도를 구할 수 있으며, 식 (2)의 Tm 1 vs.
표 2에 나타낸 올리고뉴클레오티드 중 프로브(PB-1)와 중 앙 부분과 말단 부분에 미스매치 염기배열을 가진 미스매치 (MR-2 ~ MR-33) 올리고뉴클레오티드의 온도에 대한 UV-absorbance를 lpM - 10/zM 범위의 농도로 측정하여 융 해곡선을 얻었다. 이 결과에 의해 각 농도에 대한 융해온도 를 구할 수 있었으며, 각 미스매치 올리고뉴클레오티드의 여러 농도에서의 융해온도를 표 3에 정 리하여 나타내었다.
UV 흡광도를 이용한 열역학법 및 최근접 염기대 모델에 의해 상보적 및 각 미스매치 올리고뉴클레오티드의 DNA hybridization 현상을 분석하는 것이 가능했으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 0.2μM 스 케일의 이중나선 DNA를 일본 Nisshinbo에 위탁 합성 및 HPLC 정제하여 사용하였다. 각 올리고뉴클레오티드의 염기 배열은 표 2에 나타내었다.
성능/효과
따라서 mRNA 로부터 역전사 효소로 합성한 상보적 DNA(cDNA)나 화학적으로 합성된 일염기 올리고뉴클레오티 드를 프로브로 사용하여 임의적으로 DNA hybridization을 시 키면 두 종간의 진화와 유전적 관련성 정도를 결정하거나 DNA에 존재하는 반복 염기배열의 수를 결정하는데 이용될 수 있다. 이 방법의 원리는 DNA를 고온처리하면 이 중 나선 구조가 풀려서 일염기로 분리되고, 또 온도를 식히면 상보적 인 DNA끼리 다시 재결합하는 DNA의 특성을 기초로 한 것 이다(3)
(표 4, 5 참조). 따라서 UV 흡광도를 이용한 열역학법에 의해 DNA hybridization 현상을 분석하는 것이 가능하며, 최근 접 염기대 모델 계산법으로도 DNA hybridization 현상을 예 측하는 것이 가능하다는 것을 알 수 있다.
값을 비교해 보면, 미스매치 염기배열이 말단부 위치하는 경우가 더 안정한 상태를 나타내고 있다. 역으로 해석하면, 미스매치 염기배열이 중앙부에 위치 할수록 DNA hybridization이 어렵다는 것을 알 수 있다.
다음 미스매치 올리고뉴클레오티드 MR-2와 MR-22 혹은 MR-3와 MR-33를 이용하여 미스매치 염기배열의 개수에 대한 JG37 값을 비교해 보면, 미스매치 염기배열의 개수가 적 을수록 더 안정한 상태를 나타내고 있으며, 미스매치 염기배 열의 개수가 많을수록 DNA hybridization이 어렵다는 것을 알 수 있다.
1) 상보적 올리고뉴클레오티드가 각 미스매치 올리고뉴클레 오티드에 비해 가장 안정한 상태를 나타내고 있으며, DNA hybridization 가장 일어나기 쉽다는 것을 알 수 있었다.
2) 미스매치 올리고뉴클레오티드 MR-2와 MR-3를 이용하여 미스매치 염기배열의 위치에 대한 JGs? 값을 비교해 보 면, 미스매치 염기배열이 말단부 위치하는 경우가 더 안 정한 상태를 나타내고 있다. 역으로 해석하면, 미스매치 염기배열이 중앙부에 위치할수록 DNA hybridization이 어 렵다는 것을 알 수 있었다.
3) 미스매치 올리고뉴클레오티드 MR-2와 MR-22 혹은 MR-3와 MR-33를 이용하여 미스매치 염기배열의 개수에 대한 #값을 비교해 보면, 미스매치 염기배열의 개수가 적을수록 더 안정한 상태를 나타내고 있으며, 미스 매치 염기배열의 개수가 많을수록 DNA hybridization이 어렵다는 것을 알 수 있었다.
후속연구
본 논문에서는 UV-흡광도를 이용하여 열역학법에 의한 DNA hybridization을 측정하였으며, 최근접 염기대 모델 (nearest neighbor base-pair model)을 이용하여 얻은 상보적 및 각 미스매치 올리고뉴클레오티드의 반응 특성과 비교 분 석한 결과를 서술하였다. 이 결과를 바탕으로 상보적 및 각 미스매 치 올리고뉴클레오티드는 열역학적으로 차이가 있음을 확인하였으며, DNA칩 마이크로어레이나 전기화학적 방법을 이용한 DNA 센서 개발의 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
참고문헌 (6)
J. D. Watson, F. H. C. Crick, 'Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid', Nature, vol. 171, pp.737-738, 1953
N. Sugimoto, S. Nakano, M. Yoneyama, 'Thermodynamics-structure relationship of single mismatches in RNA/DNA duplexes', Biochemistry, vol. 39, pp.11270-11281, 2000
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