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문제 정의
- 본 연구에서는 남해안의 거제도 해금강 연안에서 채집한 해면동물 Penares incrushms의 유기용매 추출물이 상당한 brine shrimp lethality를 나타냄에 따라, 이 추출물로부터 대사물질들을 분리해 화학적 구조를 밝히고자 하였다. 그러나 추적하고자 의도하였던 물질을 분리, 구조를 구명하는 과정에서 예상하지 않았던 물질인 saringosterol 의 존재를 확인한바, 이에 대한 결과를 보고하고자 한다. 이 시료의 유기 조추출물로부터 화학성분에 대한 추적은 TLC 및 NMR 분광분석에 의하여 이루어졌다.
- 본 연구에서는 남해안의 거제도 해금강 연안에서 채집한 해면동물 Penares incrushms의 유기용매 추출물이 상당한 brine shrimp lethality를 나타냄에 따라, 이 추출물로부터 대사물질들을 분리해 화학적 구조를 밝히고자 하였다. 그러나 추적하고자 의도하였던 물질을 분리, 구조를 구명하는 과정에서 예상하지 않았던 물질인 saringosterol 의 존재를 확인한바, 이에 대한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 이들 분획에 대한 brine 아rrimp lethality를 측정한 결과 n-hexane층이 상당한 활성 (LD50 200 ppm)을 보여 주었다. n-Hexane층을 분리하고 용매를 제거한 후에 얻어진 잔류물에 대하여 silica g이 고속 감압 크로마토그래피를 실시하였다. 용리 용매로는 5% ethyl acetate/n-hexane의 혼합액에서부터 시작하여 ethyl acetate# 5%씩 증가 시켜 70% ethyl acetate/n-hexane까지 사용하였으며, 계속해서 100% ethyl acetate, acetone, methanol을 순서대로 용출 시켜 모두 17개의 분획을 얻었다.
- Mass 측정은 기초과학지원연구원에 의뢰하여 이루어졌으며, IR spectra는 Matton사의 GALAXY 6020 spectrometer를 이용하였다. 그리고 UV spectra는 HP 8453 spectrometer를 이 용하였으며, Optical rotation은 3.5 x 50 mm cell을 이용하여 JASCO사의 DIP-1000 Digital polarimeter로 측정하였다.
- n-Hexane층을 분리하고 용매를 제거한 후에 얻어진 잔류물에 대하여 silica g이 고속 감압 크로마토그래피를 실시하였다. 용리 용매로는 5% ethyl acetate/n-hexane의 혼합액에서부터 시작하여 ethyl acetate# 5%씩 증가 시켜 70% ethyl acetate/n-hexane까지 사용하였으며, 계속해서 100% ethyl acetate, acetone, methanol을 순서대로 용출 시켜 모두 17개의 분획을 얻었다. 이렇게 얻어진 분획들에 대해 'H NMR 스펙트럼과 brine 아irimp 독성을 측정한 결과 25% ethyl acetate/n-hexane(LDso 60 ppm)이 가장 흥미 있는 결과를 나타내었다.
- 따라서 이 화합물은 2개의 입체이성체들의 혼합물로 여겨졌다. 이 사실은 HMQC 실험에 의해서 정확하게 일치하는 수소와 탄소를 assign 한 후에 白 NMR spectrum 신호에 대한 면적 비를 측정함으로써 확인되었다. 질량분석 스펙트럼의 m/e 428에서 발견된 분자 이온 신호도 탄소의 갯수가 29개임을 지지하였다.
- 그러나 추적하고자 의도하였던 물질을 분리, 구조를 구명하는 과정에서 예상하지 않았던 물질인 saringosterol 의 존재를 확인한바, 이에 대한 결과를 보고하고자 한다. 이 시료의 유기 조추출물로부터 화학성분에 대한 추적은 TLC 및 NMR 분광분석에 의하여 이루어졌다.
- 문헌 조사 결과 이 스테로이드는 갈조류에서 분리된 (24R)과 (24S)-saringosterol (la와 lb) 의 균등한 혼합물이란 것이 확인되었으며 보고된 'H NMR값과 비교하였더니 잘 일치히였다(Ikekawa et alz 1966; Catalan et alz1983). 하지만 saringosterol의 13C NMR에 대해서는 아직 까지 보고된 바 없기 때문에 이차원적 NMR 분광 기법을 사용하여 이 화합물의 13C NMR 신호를 정확하게 지 정하였다. Saringoster 이은 지금까지지 주로 갈조류에서 분리되 었으 며 육상식물과 해면동물 등에서도 분리되었다(Ikekawa et alz 1966; 1968; Patterson, 1968; Knights, 1970; Shibata et al, 1978; Francisco et al, 1979; Newburger et al, 1979; Popov et al, 1985; Cho and Djerassi, 1987; Pandey et alz 1988; Kurata et al, 1990; Volkman et al, 1994; Virtur and Nichols, 1994; Milkova et al, 1997; Zhu et al, 2000; Ukiya et al, 2001).
- 해면동물 P incrustans 시료를 거제도 해금강 연안에서 SCUBA 다이빙에 의하여 채집하였으며, 채집한 시료를 메탄올로 반복해서 추출한 후에 다시 dichloromethane으 로 반복 추출하였다. 얻어진 유기 조추줄물을 n-butanol과 물을 이용하여 분배한 후 n-butanol층은 다시 15% 메 탄 올 수용액 층과 n-hexane으로 분배하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 주요 NMR 용매는 CDCh이며 모든 측정은 24C에서 이루어졌다. HPLC는 Spectra-physics의 Isochrom isocratic pump를 중심으로 Rheodyne 7825 injector, Shodex RI detector 그리고 Line ar 2-pen recorder로 구성하여 본 실험실에서 조립되어졌 고, 물질 분리에 사용된 HPLC colume은 YMC silica semi prep column (1X25 cm), YMC C】8 reversed-phase semi prep column (lx25cm) 오卜 각각의 guard column catridge (Aldrich)를 사용하였다. Mass 측정은 기초과학지원연구원에 의뢰하여 이루어졌으며, IR spectra는 Matton사의 GALAXY 6020 spectrometer를 이용하였다.
- HPLC는 Spectra-physics의 Isochrom isocratic pump를 중심으로 Rheodyne 7825 injector, Shodex RI detector 그리고 Line ar 2-pen recorder로 구성하여 본 실험실에서 조립되어졌 고, 물질 분리에 사용된 HPLC colume은 YMC silica semi prep column (1X25 cm), YMC C】8 reversed-phase semi prep column (lx25cm) 오卜 각각의 guard column catridge (Aldrich)를 사용하였다. Mass 측정은 기초과학지원연구원에 의뢰하여 이루어졌으며, IR spectra는 Matton사의 GALAXY 6020 spectrometer를 이용하였다. 그리고 UV spectra는 HP 8453 spectrometer를 이 용하였으며, Optical rotation은 3.
- NMR 측정은 Varian Unity 500기기를 사용하였으며 〔H NMR 스펙트럼은 주파수 500 MHz에서, 탄소는 125 MHz에서 각각 얻어졌다. 2차원 실험을 위해 필요한 변수는 표준 시료를 사용하여 얻어진 기존 값을 이용하였으며 data processing은 Varian 사에서 제공되는 VNMR soft- ware를 사용하였다.
- 2차원 실험을 위해 필요한 변수는 표준 시료를 사용하여 얻어진 기존 값을 이용하였으며 data processing은 Varian 사에서 제공되는 VNMR soft- ware를 사용하였다. 실험에 사용된 주요 NMR 용매는 CDCh이며 모든 측정은 24C에서 이루어졌다. HPLC는 Spectra-physics의 Isochrom isocratic pump를 중심으로 Rheodyne 7825 injector, Shodex RI detector 그리고 Line ar 2-pen recorder로 구성하여 본 실험실에서 조립되어졌 고, 물질 분리에 사용된 HPLC colume은 YMC silica semi prep column (1X25 cm), YMC C】8 reversed-phase semi prep column (lx25cm) 오卜 각각의 guard column catridge (Aldrich)를 사용하였다.
- 해면동물 Penares incrustans 시료는 2001년 7월에 거제도 해금강 연안의 수심 15〜20 m에서 SCUBA 다이빙에 의하여 채집하였다. 군체의 색깔은 표면이 검은색이고 내 부는 백색으로서 형태가 버섯과 비슷하였으며 약간 물렁물렁하였다.
이론/모형
- NMR 측정은 Varian Unity 500기기를 사용하였으며 〔H NMR 스펙트럼은 주파수 500 MHz에서, 탄소는 125 MHz에서 각각 얻어졌다. 2차원 실험을 위해 필요한 변수는 표준 시료를 사용하여 얻어진 기존 값을 이용하였으며 data processing은 Varian 사에서 제공되는 VNMR soft- ware를 사용하였다. 실험에 사용된 주요 NMR 용매는 CDCh이며 모든 측정은 24C에서 이루어졌다.
성능/효과
- 41) 는 스테로이드 B ring의 5 위치에 존재함이 명백하였다. 나머지 하나의 이중결합("C NMR, 5 139.08, 116.00/115.94; 'H NMR, 8 5.742/5.746, 5.177/5.186, 5.056/5.060)은 0 COSY 및 HMQC 실험에 의해서 vinyl functionality라는 것이 결정되었다. 이제 이 vinyl기와 또 하나의 hydroxy 기의 위치를 결정해야 하며 이것은 HMBC 실험에서 이루어졌다.
- 이제 이 vinyl기와 또 하나의 hydroxy 기의 위치를 결정해야 하며 이것은 HMBC 실험에서 이루어졌다. Table 2에서 보여진 것처럼 HMBC 실험에서 H-29의 0 NMR 신호(6 5.177/5.186, 5.056/5.060)와 C-24 (8 89.33/89.26) 사이에 correlation이 관찰되었으며 H-26과 H-27의 NMR 신호와 C-24 신호 사이에서도 cor- relation이 존재함이 확인되었다. 이것은 vinyl기와 hy- droxy기가 동시에 C-24에 연결되어 있음을 나타내었다 (Fig- 1).
- 얻어진 유기 조추줄물을 n-butanol과 물을 이용하여 분배한 후 n-butanol층은 다시 15% 메 탄 올 수용액 층과 n-hexane으로 분배하였다. n-Hexane 분배 분획에 대한 silica flash chromatography와 이렇게 얻어진 크로마토그래피 분획에 대한 반복적인 HPLC에의 해서 saringosterol을 분리할 수 있었으며, 이차원적 핵자기 공명 분광 기법에 의하여 이 화합물을 구성하는 탄소 원자들의 위치를 정확히 지정할 수 있었다. 이 스테로이드는 아직까지 우리나라에서 채집한 해양생물에서는 분리된 적이 없으며 이 화합물의 탄소 위치에 대한 정확한 지정도 처음으로 이루어졌다.
- 채집된 해면동물의 시료를 메탄올과 dichloromethane 으로 반복 추출한 후에 유기용매들로 분배하였으며 이들 분획에 대한'brine shrimp lethality를 측정한 결과 이미 앞에서 언급한 것처럼 n-hexane층이 상당한 활성을 보여 주었다. n-Hexane층을 분리하고 용매를 제거한 후에 얻어진 잔류물에 대하여 silica gel 고속 감압 크로마토그래 피를 실시하였으며 최종적인 분리는 이들 크로마토그래피 분획에 대한 silica 및 Cis reversed-phase HPLC에의 해서 이루어진 결과 saringosterol이었다(Fig. 1).
- 38 (1H, m)에서 발견되었다. 이 뿐만 아니라 DEFT 실험에 의해서 5개의 methyl, 11개의 methylene, 9개의 methine, 4개의 quaternary carbon들이 존재함이 밝혀졌다. 이러한 'H 및 13C NMR 신호들을 주의 깊게 분석해 보면 화합물 1이 stigmastane 계열의 스테로이드임을 알 수 있다.
- Saringosterol은 본 연구에서 이용한 brine shrimp lethality 검색에서는 전혀 활성이 없었으나, 최근에 항결핵 효과를 나타내어 상당한 관심을 불러일으켰다(Waechter et alz 2001). 이 스테로이드를 분리하는 과정 중에 n-hexane층에서 나타난 비교적 강한 brine 사irimp lethality는 이미 잘 알려진 3- alkylglycerol ether 유도체들에서 기 인하는 것으로 확인되었다.
- 이렇게 해서 얻어진 조 추출물을 n- butanol과 물을 이용하여 분배하였으며, n-butanol층은 다시 15% 메탄올 수용액 층과 n-hexane으로 분배하였다. 이들 분획에 대한 brine 아rrimp lethality를 측정한 결과 n-hexane층이 상당한 활성 (LD50 200 ppm)을 보여 주었다. n-Hexane층을 분리하고 용매를 제거한 후에 얻어진 잔류물에 대하여 silica g이 고속 감압 크로마토그래피를 실시하였다.
- 용리 용매로는 5% ethyl acetate/n-hexane의 혼합액에서부터 시작하여 ethyl acetate# 5%씩 증가 시켜 70% ethyl acetate/n-hexane까지 사용하였으며, 계속해서 100% ethyl acetate, acetone, methanol을 순서대로 용출 시켜 모두 17개의 분획을 얻었다. 이렇게 얻어진 분획들에 대해 'H NMR 스펙트럼과 brine 아irimp 독성을 측정한 결과 25% ethyl acetate/n-hexane(LDso 60 ppm)이 가장 흥미 있는 결과를 나타내었다. 25% ethyl acetate/n- hexane를 용리액으로 하여 위 분획에 대한 silica HPLC (YMC silica column, 1x25 cmz 2.
- 이 사실은 HMQC 실험에 의해서 정확하게 일치하는 수소와 탄소를 assign 한 후에 白 NMR spectrum 신호에 대한 면적 비를 측정함으로써 확인되었다. 질량분석 스펙트럼의 m/e 428에서 발견된 분자 이온 신호도 탄소의 갯수가 29개임을 지지하였다. 이 사실에 근거하여 2개의 이중결합과 2개의 oxygenated carbons (하나는 secondary, 또 다른 하나는 tertiary carbon)이 존재함이 탄소 신호 6 142.
- 채집된 해면동물의 시료를 메탄올과 dichloromethane 으로 반복 추출한 후에 유기용매들로 분배하였으며 이들 분획에 대한'brine shrimp lethality를 측정한 결과 이미 앞에서 언급한 것처럼 n-hexane층이 상당한 활성을 보여 주었다. n-Hexane층을 분리하고 용매를 제거한 후에 얻어진 잔류물에 대하여 silica gel 고속 감압 크로마토그래 피를 실시하였으며 최종적인 분리는 이들 크로마토그래피 분획에 대한 silica 및 Cis reversed-phase HPLC에의 해서 이루어진 결과 saringosterol이었다(Fig.
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