본 연구는 섬유소분해효소 유전자(CelD)가 도입된 형질전환 돼지를 생산하기 위해 사계절동안 수행하였다. 약 8∼15개월령의 순종의 랜드레이스경산돈 및 미경산돈 126두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이식을 위해 사용하였으며, 발정동기화 및 과배란 방법은 PG600 주입 후 9일간 매일 20mg의 altrenogest를 사료에 첨가하여 급여하였다. Altrenogest를 9일간 급여 후 1000IU의 PMSG와 750IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다. 미세주입을 위한 유전자는 Rat elasterase promoter에 CelD유전자를 연결하여 준비하였으며, 호르몬 처리후 91두의 공란돈으로부터 1,422개의 난자를 회수하였으며 이중 95.6% (1,359/1,422)는 DNA미세주입을 위해 전핵을 관찰 할 수 있는 1세포기의 수정란이었다. 이중 유전자가 미세주입된 725개의 난자를 35두의 수란돈에 이식하였으며 13두의 임신돈으로부터 65두의 자돈을 생산하였다. 한편 수란돈당 수정란 이식수가 임신율에 미치는 영향을 조사한 결과 약 21∼24개의 수정란을 이식한 구에서 임신율이 50%로 타구의 20.0%(20개 이하)와 33.3%(25개 이상)보다 높았으며, 꼬리조직으로부터 분리된 DNA의 PCR검정결과 65두중 5두가 형질전환 양성 반응을 나타내어 7.69%의 형질전환율을 나타내었다 따라서 본 연구는 생체반응기를 통한 형질전환 돼지생산을 위한 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
본 연구는 섬유소분해효소 유전자(CelD)가 도입된 형질전환 돼지를 생산하기 위해 사계절동안 수행하였다. 약 8∼15개월령의 순종의 랜드레이스경산돈 및 미경산돈 126두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이식을 위해 사용하였으며, 발정동기화 및 과배란 방법은 PG600 주입 후 9일간 매일 20mg의 altrenogest를 사료에 첨가하여 급여하였다. Altrenogest를 9일간 급여 후 1000IU의 PMSG와 750IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다. 미세주입을 위한 유전자는 Rat elasterase promoter에 CelD유전자를 연결하여 준비하였으며, 호르몬 처리후 91두의 공란돈으로부터 1,422개의 난자를 회수하였으며 이중 95.6% (1,359/1,422)는 DNA미세주입을 위해 전핵을 관찰 할 수 있는 1세포기의 수정란이었다. 이중 유전자가 미세주입된 725개의 난자를 35두의 수란돈에 이식하였으며 13두의 임신돈으로부터 65두의 자돈을 생산하였다. 한편 수란돈당 수정란 이식수가 임신율에 미치는 영향을 조사한 결과 약 21∼24개의 수정란을 이식한 구에서 임신율이 50%로 타구의 20.0%(20개 이하)와 33.3%(25개 이상)보다 높았으며, 꼬리조직으로부터 분리된 DNA의 PCR검정결과 65두중 5두가 형질전환 양성 반응을 나타내어 7.69%의 형질전환율을 나타내었다 따라서 본 연구는 생체반응기를 통한 형질전환 돼지생산을 위한 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
This study was performed during the four seasons for the production of transgenic pigs containing the Cellulase Digest Gene. Purebred Landrace gilts and sows approximately 8∼15 months of age (n=126) were used for the collection of 1-cell zygotes for DNA microinjection and transfer. Retrospectively, ...
This study was performed during the four seasons for the production of transgenic pigs containing the Cellulase Digest Gene. Purebred Landrace gilts and sows approximately 8∼15 months of age (n=126) were used for the collection of 1-cell zygotes for DNA microinjection and transfer. Retrospectively, estrus synchronization and superovulation schemes were evaluated to assess practicality fur zygote collection. Synchronization and superovulation procedures were used that cyclic gilts were synchronized with 20mg altrenogest (ALT) per day for 9 days after PG600 administration followed by superovulation with 1000 IU pregnant mares serum gonadotropin (PMSG) and 750IU human chorionic gonadotrophin (hCG). The cellulase digestion gene for microinjection is rat elasterase promoter (rEl) linked to CelD gene. After hormone treatment, 1,422 embryos were collected from 91 donors and 95.6% (1,359/1,422) embryos were in 1-cell stage which can be visualized the pronuclei for DNA microinjection. A total of 725 DNA microinjected embryos transferred into 35 recipients and produced 65 piglets from 13 litters. Pregnancy rate according to the number of transferred embryos to recipients was higher the group which received 21 to 24 embryos (50.0%) than other groups 20.0% in less and 33.3% in more. A tail tissue was collected from 65 piglets for biopsy. PCR screening was performed on each DNA sample using two separate sets of primers specific for the 5'- and 3'-flanking region of the rEl-CelD gene. Five of the 65 piglets (7.69%) were positive for the transgene. This study provide useful information regarding production of transgenic pig for bioreactor research.
This study was performed during the four seasons for the production of transgenic pigs containing the Cellulase Digest Gene. Purebred Landrace gilts and sows approximately 8∼15 months of age (n=126) were used for the collection of 1-cell zygotes for DNA microinjection and transfer. Retrospectively, estrus synchronization and superovulation schemes were evaluated to assess practicality fur zygote collection. Synchronization and superovulation procedures were used that cyclic gilts were synchronized with 20mg altrenogest (ALT) per day for 9 days after PG600 administration followed by superovulation with 1000 IU pregnant mares serum gonadotropin (PMSG) and 750IU human chorionic gonadotrophin (hCG). The cellulase digestion gene for microinjection is rat elasterase promoter (rEl) linked to CelD gene. After hormone treatment, 1,422 embryos were collected from 91 donors and 95.6% (1,359/1,422) embryos were in 1-cell stage which can be visualized the pronuclei for DNA microinjection. A total of 725 DNA microinjected embryos transferred into 35 recipients and produced 65 piglets from 13 litters. Pregnancy rate according to the number of transferred embryos to recipients was higher the group which received 21 to 24 embryos (50.0%) than other groups 20.0% in less and 33.3% in more. A tail tissue was collected from 65 piglets for biopsy. PCR screening was performed on each DNA sample using two separate sets of primers specific for the 5'- and 3'-flanking region of the rEl-CelD gene. Five of the 65 piglets (7.69%) were positive for the transgene. This study provide useful information regarding production of transgenic pig for bioreactor research.
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문제 정의
69%의 형질전환율을 나타내었다. 따라서 본 연구는 생체반응기를 통한 형질전환 돼지생산 을 위한 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
췌장에서 이들 소화관련 효소를 분비하기 위해서는 췌장에서 특이적으로 생성되는 최소한 9개 중에 1개가 serine protease인 rat elastase I (rEl)의 5측 enhancer를 활용함으로서 췌장 외분비선인 acinar cell에서 CelD유전자를 고효율로 발현시키는 것이 가능할 것으로 추측하였다. 따라서 본 연구의 목적은 섬유소 분해효소를 갖고 있는 형질전 환돼지를 생산함으로써 섬유소를 고 에너지원으로 활용하여 체지방을 줄이고, 저 콜레스테롤 고품질 돈육을 생산하는 형질전환 돼지를 생산하기 위해 수행하였다.
본 연구는 섬유소분해효소 유전자(CelD)가 도입된 형질전환 돼지를 생산하기 위해 사계절동안 수행하였다. 약 8~15개월령의 순종의 랜드레이스 경산돈 및 미경산돈 126두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이.
제안 방법
PG600 (Intervert International, B.V Boxmeer, Holland) 주입 후 9일간 Altrenogest (Regumate, Hoechst Roussel Pharmaceuticals Inc., Somerville, NJ) 를 매일 두당 사료 2kg에 20mg을 혼합하여 급여 하 였으며 그후 과배란은 PMSG(Intervert International, B.V Boxmeer, Holland)를 1000IU 근육주사한 후 72시간이 경과되 었을 때 750IU의 hCG를 근육주사 하여 과배란을 실시한다.
hCG (Intervert International, B.V Boxmeer, Holland) 투여후 매일 09시와 18시에 2회씩 육안적 관찰을 실시하여 점액의 유무, 음부의 상태 및 부동자세 등 발정 초기증상이 나타난 종빈돈에 한하여 성성숙된 수퇘지를 접촉시켜 최초 수퇘지 허용시 1회 자연교배를 실시하였으며 1회 자연교배 후 24 시간에 2회 교배를 실시하였다.
Labarato- ries, USA)를 난관 관류시킴으로써 수정란을 회수 하였다. 관류된 D-PBS는 멸균시험튜브에 수집하여 실온에서 난자를 회수하여 실체현미경상에서 수정 유무를 판단한 후 1세포기 수정란만를 이용 하였다.
돼지의 수정란을 이식하여 산자를 생산할 목적으로 외과적인 방법에 의해서 수정란 이식을 실시하였다. 먼저 호르몬 처리에 의해서 발정이 동기화 된 수란돈 또는 자연적으로 발정주기가 동기화된 수란돈을 전신마취를 실시한다.
먼저 호르몬 처리에 의해서 발정이 동기화 된 수란돈 또는 자연적으로 발정주기가 동기화된 수란돈을 전신마취를 실시한다. 마취된 수란돈의 정중선을 중심으로 광범위하게 면도기를 이용하여 털을 제거하고 소독을 실시한 다음 정중선을 약 10~ 15cm를 절개하여 생식기를 노출시킨 후 난소 표면의 황체의 존재를 확인한 후, 수정란 20~50개가 함유된 배양액의 채워진 polycatether (Cook, Austraila)를 난관 팽대부에 넣고, 수정란이 함유된 배양액을 1ml 주사기를 이용하여 이식하였다.
마취제로는 하이프노딜(JANSSEN, German) 7 ~8ml를 돼지 귀 정맥에 주입하여 1차 마취를 실시하고, 그 후 가연성 흡입마취제인 할로탄 가스(신성신약) 3~5%를 산소(600~ 1,000ml/분) 순환 시스템에 연결하여 마취상태를 유지시키면서 공란돈 의 난관은 자궁- 난관접합부에 18gage 주사바늘을 이용하여 1회용 주사기로 1% BSA(Sigma, USA)와 항생제를 혼합한 25ml의 D-PBS(Gibco . Labarato- ries, USA)를 난관 관류시킴으로써 수정란을 회수 하였다. 관류된 D-PBS는 멸균시험튜브에 수집하여 실온에서 난자를 회수하여 실체현미경상에서 수정 유무를 판단한 후 1세포기 수정란만를 이용 하였다.
1과 같다. 먼저 목적유전자를 소 의 제4위에서 기생하는 미생물로부터 전체유전자 를 분리한 후 DNA library# 작성하고 이들 library 로부터 섬유소분해효소 유전자를 클로닝하였으며, Promoter의 경우 흰쥐의 조직으로부터 genome DNA 를 추출한 후 Gene Bank의 유전자 배열을 참고로 클로닝 하였다. 클로닝된 각각의 유전자는 약 200 bp의 rElastase I promoter 하류에 약 2.
처리 후 이들 시료를 꺼내 같은 양의 phenol 을 첨가하여 genome DNA를 분리하였다. 분리된 genome DNA는 제작된 Primer(Forward 5, -TGC TGA TAA GAG CCG TAT AAA G-3', Reverse 5'-ATT TGC ATC TAT AGT CGC CTT T-3')< 이용 PCR mixture를 만든 후 94℃ 에서 1분, 58 ℃ 에서 1분, 72℃에서 1분간 35cycle를 반복한 후, PCR산물은 1% agarose gel을 이용하여 전기영동 을 실시하였다.
약 8~15개월령의 순종의 랜드레이스 경산돈 및 미경산돈 126두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이.식을 위해 사용하였으며, 발정동기화 및 과배란 방법은 PG600 주입 후 9일간 매일 20mg의 altrenogest를 사료에 첨가하여 급여하였다. Altrenogest를 9일간 급여 후 1000IU의 PMSG와 750IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다.
그리고 모든 micropipet의 끝을 microforge로 15-30° 정도 구부려서 사용한다. 외래 유전자의 미세 주입은 미세 조작기 (micromani- pulatpr : Nikon, Japan)를 이용하여 수정란의 웅성 전핵에 주입하였는데, 이때 핵막의 용이한 관찰과 실험의 편리함을 도모하기 위하여 DIC system을 갖춘 도립현미경하에서 수행하였으며 , 외래유전자의 미세주입시 농도와 양은 2pg/2pl로 약 600 copies 에 해당되며, 또한 체내수정란의 전핵 노출을 위해 15,000rpm에서 15분간 원심분리를 실시하였다.
재조합 발현벡터는 다시 pBluSK(+)벡터에서 클로닝하여 초원심분리 방법으로 순수 정제시킨 후 EcoR I과 Sall 제한효소로 목표하는 부위만을 절단하였다. 제한효소 처리된 단편들을 0.
재조합 발현벡터는 다시 pBluSK(+)벡터에서 클로닝하여 초원심분리 방법으로 순수 정제시킨 후 EcoR I과 Sall 제한효소로 목표하는 부위만을 절단하였다. 제한효소 처리된 단편들을 0.9% 아가로 즈겔 전기영동 후 이들의 DNA 단편을 아가로즈로 부터 회수하고 2회 정제하였으며, 최종농도는 2~ 4 ng/ul로 희석하여 미세주입용 발현벡터로 준비하였다.
5% SDS가 첨가된 TE-buffer 15 ml을 첨가하여 37℃에서 1시간 둔 후 lOOeg/ml proteinase K(Merk, Damstadt, Germany)을 첨가하고 즉시 55℃의 incubator에서 3시간 동안 용해시켰다. 처리 후 이들 시료를 꺼내 같은 양의 phenol 을 첨가하여 genome DNA를 분리하였다. 분리된 genome DNA는 제작된 Primer(Forward 5, -TGC TGA TAA GAG CCG TAT AAA G-3', Reverse 5'-ATT TGC ATC TAT AGT CGC CTT T-3')< 이용 PCR mixture를 만든 후 94℃ 에서 1분, 58 ℃ 에서 1분, 72℃에서 1분간 35cycle를 반복한 후, PCR산물은 1% agarose gel을 이용하여 전기영동 을 실시하였다.
대상 데이터
Altrenogest를 9일간 급여 후 1000IU의 PMSG와 750IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다. 미세주입을 위한 유전자는 Rat elasterase promoter에 CelD 유전자를 연결하여 준비하였으며, 호르몬 처리후 91두의 공란돈으로 부터 1, 422개의 난자를 회수하였으며 이 중 95.6% (1, 359/1, 422)는 DNA미세주입을 위해 전핵을 관찰할 수 있는 1세포기의 수정란이었다. 이 중 유전자 가 미세주입된 725개의 난자를 35두의 수란돈에 이식하였으며 13두의 임신돈으로부터 65두의 자돈을 생산하였다.
외경이 1mm이고 길이가 13cm인 유리관 (Gamer glass, USA)으로 고정용과 주입용의 micropipets을 제작한다. 먼저 이 유리관을 puller(David korf 720, USA)에 장치한 다음 끝의 길이가 1~ 1.
6% (1, 359/1, 422)는 DNA미세주입을 위해 전핵을 관찰할 수 있는 1세포기의 수정란이었다. 이 중 유전자 가 미세주입된 725개의 난자를 35두의 수란돈에 이식하였으며 13두의 임신돈으로부터 65두의 자돈을 생산하였다. 한편 수란돈당 수정란 이식수가 임신율에 미치는 영향을 조사한 결과 약 21 ~24개의 수정란을 이식한 구에서 임신율이 50%로 타구의 20.
성능/효과
2와 같다. CelD 특이 Primer에 의한 PCR수행 후 전기영동 결과를 VI74 Hae DI 로 digested된 pUC18 Size marker와 비교한 결과 예측된 크기의 약 600bp에서 band 를 확인할 수 있었다.
수정란의 발달 단계에 대한 변이는 배란 시점 에서의 조절이 중요하므로 배란유기시 hCH주입 시기에 의해 좌우될 수 있다(Soede 등, 1992). 그러므로 우리의 결과는 hCG 주입 농도를 500 내지 750IU를 주입함으로써 과배란을 유기할 수 있었으며 동기화된 One cell stage의 수정란을 회수할 수 있었다. 이식 시 수정란의 수가 임시율에 미치는 영향에 관한 연구는 Brem 등(1985), Wei 등(1993)에 의해 보고되었으며 우리의 보고되지 않은 결과에 의하면 21~24개의 수정란을 이식 시 그보다 적거나 많은 수의 수정란 이식시 보다 약간의 차이을 보였는데 이것은 1993년 Wei 등의 보고와 거의 유사한 것으로 바서 수정란의 수가 임신율에 미치는 영향은 크지 않은 것으로 보며, 다만 미세 주입된 난자와 그렇지 않은 난자를 이식할 시에는 약간의 차이가 있는 것으로 보고되었다(Eyestone 등, 1994).
유전자 주입된 725개의 수정란은 총 35두의 수란돈에 외과적인 방법으로 이식하였다. 수란돈 마리당 이식된 수정란수는 평균 21개였으며, 분만두수 13두, 산자수 65두로 분만율은 37.1%, 마리당 평균 산자수는 5두였다.
총 35두의 수란돈에 대한 미세주입된 수정란의 이식 결과 및 분만 결과는 Table 2와 같다. 외과적 방법으로 채란된 1, 359개의 수정란 중 전핵내 유전자를 미세주입한 전체 수정란수는 725개로 1세포 기 수정란 대비 53.3%였다. 유전자 주입된 725개의 수정란은 총 35두의 수란돈에 외과적인 방법으로 이식하였다.
성적 호르몬 처리에 의한 발정동기화 및 과배란 처리된 돼지의 외과적인 방법에 의한 과배란 및 수정란 회수 성적은 Table 1과 같다. 총 91두의 공란돈 으로부터 1, 422개의 난자를 회수하였으며 그 중 1, 359개가 1-cell 단계의 수정란으로 전체 회수란 중 약 95.6%이며, 공란돈 1두당 평균 회수된 수정 란수는 14.9 개였다.
소화효소는 체장의 uacinar cell" 에서 합성되어, zymogen granule에 packaging되며, 이는 다시 소장호로몬의 일종인 cholecystoknin (CCK)의 작용에 의하여 십이지장으로 분비될 것이다. 췌장에서 이들 소화관련 효소를 분비하기 위해서는 췌장에서 특이적으로 생성되는 최소한 9개 중에 1개가 serine protease인 rat elastase I (rEl)의 5측 enhancer를 활용함으로서 췌장 외분비선인 acinar cell에서 CelD유전자를 고효율로 발현시키는 것이 가능할 것으로 추측하였다. 따라서 본 연구의 목적은 섬유소 분해효소를 갖고 있는 형질전 환돼지를 생산함으로써 섬유소를 고 에너지원으로 활용하여 체지방을 줄이고, 저 콜레스테롤 고품질 돈육을 생산하는 형질전환 돼지를 생산하기 위해 수행하였다.
이 중 유전자 가 미세주입된 725개의 난자를 35두의 수란돈에 이식하였으며 13두의 임신돈으로부터 65두의 자돈을 생산하였다. 한편 수란돈당 수정란 이식수가 임신율에 미치는 영향을 조사한 결과 약 21 ~24개의 수정란을 이식한 구에서 임신율이 50%로 타구의 20.0%(20개 이하)와 33.3%(25개 이상)보다 높 았으며, 꼬리조직으로부터 분리된 DNA의 PCR검 정결과 65두 중 5두가 형질전환 양성 반응을 나타내어 7.69%의 형질전환율을 나타내었다. 따라서 본 연구는 생체반응기를 통한 형질전환 돼지생산 을 위한 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
후속연구
결론적으로 우리의 data에서 보는 바와 같이미 세주입 방법을 통해 생산된 형질전환 돼지를 이용하여 섬유소 소화율을 개선할 수 있다면 돼지 사 육에 있어 사료효율을 높이고 생산성을 향상시키 는데 일조할 것으로 기대한다.
비 반추동물, 특히 돼지의 경우 섬유소 소화효율이 극히 낮은 것으로 알려져 있는데, 이는 식물세포벽을 분해하는 섬유 소분해효소가 이들 동물에게는 생산되지 않기 때문이다. 식물세포벽을 소화하는 cellulase 효소를 췌장에 분비시킬 경우 소화효율이 적어도 10-30% 이상 향상 가능할 것으로 추정되며, 또한 농후사료가 아닌 열악한 조사료의 이용효율도 크게 향상될 것으로 기대된다. 소화효소는 체장의 uacinar cell" 에서 합성되어, zymogen granule에 packaging되며, 이는 다시 소장호로몬의 일종인 cholecystoknin (CCK)의 작용에 의하여 십이지장으로 분비될 것이다.
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